מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

הפרעת RNA היא אחד הכלים העיקריים המשמשים לגנטיקה הפוכה אצל יתושים ולידה דרך הפה מאפשרת לנו לגרום ולשמור על השתקת גנים אצל יתושים בוגרים ללא צורך בהזרקה זעירה. אספקה דרך הפה של RNA דו-גדילי ליתושים בוגרים היא שיטת הפרעת RNA זולה ורב-תכליתית המפחיתה באופן משמעותי את העבודה ואת הזמן והמאמץ לחקר תפקוד הגנים. שיטה זו יכולה לשמש לחקר לא רק גנים מטרה אחרים באנופלס גמביה, אלא גם באנופלסים אחרים בעלי עניין כגון אנופלס לבינאמוס.

כדי להתחיל, לגדל תרבית ממושבת חיידקים אחת של זן Escherichia coli HT115(DE3) המכילה את הרנ"א הדו-גדילי המבטא פלסמיד בחמישה מיליליטרים של ליברות המכילות אמפיצילין וטטרציקלין על שייקר פלטפורמה במשך 12 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד. לאחר 12 שעות, יש ליטול 0.5 מיליליטר מתרבית החיידקים שגדלה במהלך הלילה ולבצע דילול אחד ל-1000 במדיית טריפטון של 2X שמרים המכילה אמפיצילין וטטרציקלין. כדי לגרום לייצור RNA דו-גדילי, הוסיפו IPDG בריכוז הסופי של 40 מיקרומולר.

לאחר מכן הדגירו את התרבות במשך שעתיים בתנאי טלטול כפי שהוכח. בסוף הדגירה כאשר הצפיפות האופטית של התרבית מגיעה ל-0.4 ב-600 ננומטר, מזרים את תאי החיידקים על ידי צנטרפיקציה ב-4, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ואז שוטפים את התאים בנפח אחד של PBS. לאחר שסובבו את התאים פעם נוספת, החיזרו את התאים ב-PBS ודגרו בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.

לאחר שהחום הורג את החיידקים, מכינים אליקוטים בנפח של 400 מיקרוליטר ומאחסנים אותם בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. ערבבו 400 אליקוטים של מיקרוליטר אחד של חיידקים מוכי הפשרה הורגים בחום המבטאים רנ"א דו-גדילי עם 1.6 מיליליטרים של תמיסת סוכר של 12% המכילה 0.2% מתילפרבן. משרים כדור צמר גפן קטן בתמיסה זו ומניחים אותו בתוך כלוב המכיל יתושים בני חמישה ימים ומבטיחים שהיתושים ניזונים מתמיסה זו.

החליפו את כדור הצמר גפן ספוג בתמיסת סוכר RNA דו-גדילית כל יומיים במשך שמונה ימים רצופים, והבטיחו שהכלוב נשמר בתנאים קבועים. כדי להרדים את היתושים בקור, מניחים את המיכל על הקרח עד שהיתושים מפסיקים לזוז, ואז מניחים את היתושים על משטח קר כדי לבודד את הנקבות לנתיחה. לאחר ריסוס היתושים באתנול, הניחו אותם על משטח זכוכית עם PBS.

עם זוג מלקחיים, מאבטחים את ראש היתוש ומושכים את בית החזה לאט מאוד ומאפשרים לבלוטות הרוק להשתחרר ל- PBS. לאחר שבלוטות הרוק מנותחות מ -10 יתושים, משכו את הבלוטות להפקת RNA. עם השלמת מיצוי הרנ"א, השעו את כדור הרנ"א ב-30 מיקרוליטרים של מים חופשיים מ-RNA.

מדוד את הספיגה וחשב את ריכוז הרנ"א כמתואר בכתב היד של הטקסט. באמצעות ערכת שעתוק הפוכה מסחרית, סינתזו cDNA ממיקרוגרם אחד של RNA. דיללו את ה-cDNA 10 פעמים והגדירו את תגובות ה-RTPCR בטריפליקטים לגנים של מטרה וניקיון בית בהתאם להמלצות היצרן.

הגבר את ה- CDNA עם תנאי PCR סטנדרטיים בזמן אמת. כדי להעריך את היכולת להאכיל בדם, הניחו קבוצות של 15 נקבות יתושים שטופלו במטרה ובדקו רנ"א דו-גדילי בכלובים קטנים והרעיבו אותם במשך ארבע שעות. ספקו דם זול מדפיבריל ליתושים באמצעות אמבט מים במחזור שנקבע ל-37 מעלות צלזיוס, מאכילי יתושי זכוכית וממברנת מילוי פרי.

שימו לב, ספרו ותיעדו את מספר ניסיונות הבדיקה להשיג בהצלחה ארוחת דם מחמש הנקבות הראשונות כדי להסתבך באופן מלא בכל קבוצה. לאחר בידוד רקמות טריות ו- PBS הוכיח בעבר, תקן אותו באצטון קר כקרח למשך 90 שניות. לאחר מכן לשטוף את הרקמה מספר פעמים ב- PBS ולדגום עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם אנטי סרום מדולל ב- PBS.

בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמה מספר פעמים עם PBS. מוסיפים נוגדנים משניים פלואורסצנטיים המדוללים ב-PBS, ודוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. מוסיפים כל כתם נגדי 30 דקות לפני תום הדגירה של שעתיים.

לאחר שעתיים, לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן להרכיב את הרקמות ב 100% גליצרול על מגלשת מיקרוסקופ סטנדרטית עם כיסוי בעובי 1 מילימטר אחד להחליק ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס עד ההדמיה. נתוני ביטוי המיקרו-אריי הראו שהביטוי של כל הגנים שנבחרו בבלוטות הרוק הבוגרות ורמות ה-AAPP והמרווה היו גבוהות במיוחד. הרנ"א הדו-גדילי הפחית למעשה את שפע תעתיקי ראש המזלג בבלוטת הרוק.

היתושים שניזונו מיתושים בעלי רנ"א דו-גדילי עם ראש המזלג הציגו פי חמישה יותר ניסיונות האכלה מאשר קבוצת הביקורת או FEG דו-תאי מין דו-גדילי RNA שניזונו מיתושים כדי להיות מלאים בדם. רמות המרווה והכתמת ה-CrebA הופחתו במידה ניכרת בכל אונות בלוטת הרוק בעקבות הפרעה ל-RNA של ראש המזלג בהשוואה להפרעות RNA לבקרת נמלים. כאשר בוחנים חלבונים רבים המרכיבים את הרוק, רמות ה-AAPP הופחתו בכל שלוש אונות בלוטת הרוק בעקבות הפרעה ל-RNA ראש מזלג בהשוואה לטיפול בהפרעות RNA מבוקרות.

מצד שני, לא נצפו שינויים ברמות המוצין. נתונים אלה מצביעים על כך שראש המזלג תורם באופן שונה לביטוי של גנים שונים של חלבוני רוק. פלואורסצנציה מופחתת של Rab11 נצפתה באונות צידיות דיסטליות בעקבות טיפול בהפרעה ל-RNA של ראש מזלג, אולם גם אות Rab11 מוגבר באונות הצידיות המדיאליות והפרוקסימליות התרחש.

לא נצפה הבדל ניכר באות האדום של הנילוס לאחר הפרעת RNA של ראש המזלג בהשוואה לטיפול בהפרעות RNA בקרה. תגובת מכונת מזכירה כלשהי באופן מורכב השונה בין אונות בלוטת הרוק. טכניקה זו יכולה לאפשר לחוקרים להשתיק גנים שעבורם ניתן להפחית את הביטוי על ידי זריקה אחת של RNA דו-גדילי ולחקור אספקה דרך הפה של RNA דו-גדילי כדי להשתמש ב-RNAi כשיטת בקרה וקטורית פוטנציאלית.