يعد تداخل الحمض النووي الريبي أحد الأدوات الرئيسية المستخدمة في عكس علم الوراثة في البعوض ويسمح لنا التسليم الفموي بالحث والحفاظ على إسكات الجينات في البعوض البالغ دون الحاجة إلى الحقن الدقيق. إن التسليم الفموي للحمض النووي الريبي المزدوج إلى البعوض البالغ هو طريقة تداخل الحمض النووي الريبي منخفضة التكلفة ومتعددة الاستخدامات مما يقلل بشكل كبير من العمل والوقت والجهد لدراسة وظيفة الجينات. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة ليس فقط الجينات المستهدفة الأخرى في Anopheles gambiae ، ولكن أيضا في أنوفيلات أخرى ذات أهمية مثل Anopheles albinamus.
للبدء ، قم بزراعة ثقافة من مستعمرة بكتيرية واحدة من سلالة الإشريكية القولونية HT115 (DE3) التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل والذي يعبر عن البلازميد في خمسة ملليلتر من الرطل الذي يحتوي على الأمبيسلين والتتراسيكلين على شاكر المنصة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. بعد 12 ساعة ، خذ 0.5 ملليلتر من الثقافة البكتيرية المزروعة بين عشية وضحاها وقم بإجراء واحد من كل 1000 تخفيف في وسائط تريبتون الخميرة 2X التي تحتوي على الأمبيسلين والتتراسيكلين. للحث على إنتاج الحمض النووي الريبي المزدوج ، أضف IPDG عند التركيز النهائي ل 40 ميكرومولار.
ثم احتضان الثقافة لمدة ساعتين في ظروف تهتز كما هو موضح. في نهاية الحضانة عندما تصل الكثافة البصرية للثقافة إلى 0.4 عند 600 نانومتر ، قم بتكسير الخلايا البكتيرية عن طريق التركيز عند 4،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ثم غسل الخلايا في حجم واحد من PBS. بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، أعد تعليق الخلايا في PBS واحتضنها عند 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد قتل الحرارة للبكتيريا ، اصنع أليكوتس بحجم 400 ميكرولتر وخزنها عند 20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. امزج 400 ميكرولتر من البكتيريا المقتولة بالحرارة الذائبة التي تعبر عن الحمض النووي الريبي المزدوج مع 1.6 ملليلتر من محلول السكر 12٪ الذي يحتوي على 0.2٪ ميثيل بارابين. انقع كرة قطنية صغيرة في هذا المحلول وضعها داخل قفص يحتوي على بعوض عمره خمسة أيام وتأكد من أن البعوض يتغذى على هذا المحلول.
قم بتغيير الكرة القطنية المنقوعة في محلول سكر الحمض النووي الريبي المزدوج كل يومين لمدة ثمانية أيام متتالية ، مما يضمن الحفاظ على القفص في ظل ظروف ثابتة. لتخدير البعوض بالبرد ، ضع الحاوية على الجليد حتى يتوقف البعوض عن الحركة ، ثم ضع البعوض على سطح بارد لعزل الإناث للتشريح. بعد رش البعوض بالإيثانول ، ضعه على سطح زجاجي باستخدام PBS.
باستخدام زوج من الملقط ، قم بتأمين رأس البعوض واسحب الصدر ببطء شديد مما يسمح بإطلاق الغدد اللعابية في PBS. بمجرد تشريح الغدد اللعابية من 10 بعوض ، اسحب الغدد لاستخراج الحمض النووي الريبي. عند الانتهاء من استخراج الحمض النووي الريبي ، قم بتعليق بيليه الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي.
قياس الامتصاص وحساب تركيز الحمض النووي الريبي كما هو موضح في مخطوطة النص. باستخدام مجموعة نسخ عكسي تجارية ، قم بتوليف cDNA من ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي. قم بتخفيف cDNA 10 مرات وقم بإعداد تفاعلات RTPCR في ثلاثة أضعاف للجينات المستهدفة والتدبير المنزلي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
قم بتضخيم CDNA مع ظروف PCR القياسية في الوقت الفعلي. لتقييم القدرة على تغذية الدم ، ضع مجموعات من 15 أنثى البعوض تعامل مع الحمض النووي الريبي المزدوج المستهدف والمتحكم فيه في أقفاص صغيرة وتجويعها لمدة أربع ساعات. توفير دم رخيص مزيل الرجفان للبعوض باستخدام حمام مائي متداول مضبوط على 37 درجة مئوية ، ومغذيات زجاجية للبعوض وغشاء peryfill .
مراقبة وإحصاء وتسجيل عدد محاولات التحقيق للحصول بنجاح على وجبة دم من الإناث الخمس الأولى لتصبح محتقنة بالكامل في كل مجموعة. بعد عزل الأنسجة الطازجة وقد أظهرت PBS سابقا ، قم بإصلاحها في الأسيتون البارد المثلج لمدة 90 ثانية. ثم شطف الأنسجة عدة مرات في PBS وحضانت مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع مصل مضاد مخفف في PBS.
في نهاية الحضانة ، اغسل الأنسجة عدة مرات باستخدام PBS. أضف الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المخففة في PBS ، واحتضنها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. أضف أي بقعة مضادة قبل 30 دقيقة من نهاية الحضانة لمدة ساعتين.
بعد ساعتين ، اغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم قم بتركيب الأنسجة في الجلسرين بنسبة 100٪ على شريحة مجهر قياسية مع انزلاق غطاء بسمك ملليمتر واحد وتخزينها عند 20 درجة مئوية حتى التصوير. أظهرت بيانات التعبير عن الآراي الجزئي التعبير عن جميع الجينات المستهدفة المختارة في الغدد اللعابية البالغة وكانت مستويات AAPP والمريمية مرتفعة بشكل خاص. الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل قلل بشكل فعال من وفرة نسخ رأس الشوكة في الغدة اللعابية.
أظهر البعوض الذي يتغذى على الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل برأس الشوكة خمس مرات محاولات تغذية أكثر من المجموعة الضابطة أو FEG مزدوج الجنس المزدوج الذي تقطعت به السبل بالحمض النووي الريبي الذي يتغذى على البعوض ليتم احتقانه بالكامل بالدم. تم تخفيض مستويات تلطيخ المريمية و CrebA بشكل ملحوظ في جميع فصوص الغدة اللعابية بعد تداخل الحمض النووي الريبي لرأس الشوكة مقارنة بتداخل الحمض النووي الريبي للتحكم في النمل. عند النظر في بروتينات مكونات اللعاب الوفيرة للغاية ، تم تقليل مستويات AAPP في جميع فصوص الغدد اللعابية الثلاثة بعد تداخل الحمض النووي الريبي لرأس الشوكة مقارنة بمعالجة تداخل الحمض النووي الريبي للتحكم في الحمض النووي الريبي.
من ناحية أخرى ، لم يلاحظ أي تغييرات في مستويات الميوسين. تشير هذه البيانات إلى أن رأس الشوكة يساهم بشكل مختلف في التعبير عن جينات بروتين اللعاب المختلفة. لوحظ انخفاض تألق Rab11 في الفصوص الجانبية البعيدة بعد علاج تداخل الحمض النووي الريبي لرأس الشوكة ، ومع ذلك ، حدثت أيضا زيادة في إشارة Rab11 في الفصوص الجانبية الإنسية والقريبة.
لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في إشارة النيل الحمراء بعد تداخل الحمض النووي الريبي لرأس الشوكة مقارنة بمعالجة تداخل الحمض النووي الريبي الضابط. بعض ردود فعل آلة السكرتارية بطريقة معقدة تختلف بين فصوص الغدة اللعابية. يمكن أن تسمح هذه التقنية للباحثين بإسكات الجينات التي يمكن تقليل التعبير عنها عن طريق حقنة واحدة من الحمض النووي الريبي المزدوج الخيط واستكشاف التسليم الفموي للحمض النووي الريبي المزدوج الخيط لاستخدام الحمض النووي الريبي كوسيلة محتملة لمكافحة النواقل.
