L'interferenza dell'RNA è uno dei principali strumenti utilizzati per la genetica inversa nelle zanzare e la somministrazione orale ci consente di indurre e mantenere il silenziamento genico nelle zanzare adulte senza la necessità di microiniezione. La somministrazione orale di RNA a doppio filamento alle zanzare adulte è un metodo di interferenza dell'RNA a basso costo e versatile che riduce significativamente il lavoro, il tempo e gli sforzi per studiare la funzione genica. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare non solo altri geni bersaglio in Anopheles gambiae, ma anche in un altro anofele di interesse come Anopheles albinamus.
Per iniziare, coltiva una coltura da una singola colonia batterica di Escherichia coli ceppo HT115 (DE3) contenente l'RNA a doppio filamento che esprime plasmide in cinque millilitri di lb contenenti ampicillina e tetraciclina su uno shaker di piattaforma per 12 ore a 37 gradi Celsius e 180 RPM. Dopo 12 ore, prendere 0,5 millilitri della coltura batterica coltivata durante la notte e fare una diluizione su 1000 in 2X lievito triptone media contenente ampicillina e tetraciclina. Per indurre la produzione di RNA a doppio filamento, aggiungere IPDG alla concentrazione finale di 40 micromolari.
Quindi incubare la coltura per due ore in condizioni di scuotimento come dimostrato. Alla fine dell'incubazione, quando la densità ottica della coltura raggiunge 0,4 a 600 nanometri, pellettificare le cellule batteriche per centrificazione a 4.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e quindi lavare le cellule in un volume di PBS. Dopo aver ruotato le cellule ancora una volta, risospese le cellule in PBS e incubare a 70 gradi Celsius per un'ora.
Dopo che il calore ha ucciso i batteri, fare aliquote di 400 microlitri di volume e conservarle a 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Mescolare un'aliquota di 400 microliti di batteri uccisi dal calore di scongelamento che esprimono RNA a doppio filamento con 1,6 millilitri di soluzione zuccherina al 12% contenente lo 0,2% di metilparabene. Immergere un piccolo batuffolo di cotone in questa soluzione e posizionarlo all'interno di una gabbia contenente zanzare di cinque giorni e assicurarsi che le zanzare si nutrano di questa soluzione.
Cambiare il batuffolo di cotone imbevuto di soluzione di zucchero RNA a doppio filamento a giorni alterni per otto giorni consecutivi, assicurandosi che la gabbia sia mantenuta in condizioni costanti. Per anestetizzare le zanzare con il freddo, posizionare il contenitore sul ghiaccio fino a quando le zanzare smettono di muoversi, quindi posizionare le zanzare su una superficie fredda per isolare le femmine per la dissezione. Dopo aver spruzzato le zanzare con etanolo, posizionarle su una superficie di vetro con PBS.
Con un paio di pinze, fissare la testa della zanzara e tirare il torace molto lentamente permettendo alle ghiandole salivari di essere rilasciate in PBS. Una volta che le ghiandole salivari sono sezionate da 10 zanzare, tirare le ghiandole per l'estrazione dell'RNA. Al termine dell'estrazione dell'RNA, sospendere il pellet di RNA in 30 microlitri di acqua libera da RNA.
Misurare l'assorbanza e calcolare la concentrazione di RNA come descritto nel manoscritto di testo. Utilizzando un kit commerciale di trascrizione inversa, sintetizzare il cDNA da un microgrammo di RNA. Diluire il cDNA 10 volte e impostare le reazioni RTPCR in triplicati per i geni bersaglio e di pulizia secondo le raccomandazioni del produttore.
Amplifica il CDNA con condizioni PCR standard in tempo reale. Per valutare la capacità di nutrirsi per il sangue, posizionare gruppi di 15 zanzare femmine trattate con RNA bersaglio e controllato a doppio filamento in piccole gabbie e farle morire di fame per quattro ore. Fornire sangue defibrillato a buon mercato alle zanzare utilizzando un bagno d'acqua circolante impostato a 37 gradi Celsius, alimentatori di zanzare in vetro e membrana di peryfill.
Osserva, conta e registra il numero di tentativi di sondaggio per acquisire con successo un pasto di sangue dalle prime cinque femmine a diventare completamente ingorgate in ciascun gruppo. Dopo aver isolato il tessuto fresco e PBS ha dimostrato in precedenza, fissarlo in acetone ghiacciato per 90 secondi. Quindi risciacquare il tessuto più volte in PBS e incubare con anticorpi primari durante la notte a quattro gradi Celsius con anti-siero diluito in PBS.
Alla fine dell'incubazione, lavare il tessuto più volte con PBS. Aggiungere anticorpi secondari fluorescenti diluiti in PBS e incubare al buio a temperatura ambiente per due ore. Aggiungere qualsiasi contromacchia 30 minuti prima della fine delle due ore di incubazione.
Dopo due ore, lavare il tessuto tre volte con PBS, quindi montare i tessuti in glicerolo al 100% su un vetrino per microscopio standard con uno slittamento di copertura di un millimetro di spessore e conservare a 20 gradi Celsius fino all'imaging. I dati sull'espressione di micro aray hanno mostrato l'espressione di tutti i geni bersaglio scelti nelle ghiandole salivari adulte e i livelli di AAPP e salvia erano particolarmente elevati. L'RNA a doppio filamento ha ridotto efficacemente l'abbondanza di trascritti della testa della forcella nella ghiandola salivare.
La testa della forcella alimentata con RNA a doppio filamento delle zanzare ha mostrato cinque volte più tentativi di alimentazione rispetto al gruppo di controllo o alle zanzare alimentate a doppio filamento fecondo fecondo di doppio sesso per essere completamente ingorgate di sangue. I livelli di colorazione di salvia e CrebA sono stati marcatamente ridotti in tutti i lobi delle ghiandole salivari a seguito dell'interferenza dell'RNA della testa della forcella rispetto all'interferenza dell'RNA di controllo delle formiche. Quando si considerano le proteine componenti della saliva molto abbondanti, i livelli di AAPP sono stati ridotti in tutti e tre i lobi delle ghiandole salivari a seguito dell'interferenza dell'RNA della testa della forcella rispetto al trattamento dell'interferenza dell'RNA di controllo.
D'altra parte, non sono stati osservati cambiamenti nei livelli di mucina. Questi dati suggeriscono che la testa della forcella contribuisce in modo diverso all'espressione di diversi geni della proteina della saliva. La ridotta fluorescenza di Rab11 è stata osservata nei lobi laterali distali dopo il trattamento con interferenza dell'RNA della testa della forcella, tuttavia si è verificato anche un aumento del segnale Rab11 nei lobi laterali mediali e prossimali.
Nessuna differenza percepibile è stata osservata nel segnale rosso del Nilo dopo l'interferenza dell'RNA della testa della forcella rispetto al trattamento dell'interferenza dell'RNA di controllo. qualche segretaria macchina reagisce in modo complesso che differisce tra i lobi delle ghiandole salivari. Questa tecnica potrebbe consentire ai ricercatori di silenziare i geni per i quali l'espressione può essere ridotta da una singola iniezione di RNA a doppio filamento e di esplorare la consegna orale di RNA a doppio filamento per utilizzare RNAi come potenziale metodo di controllo del vettore.
