RNA girişimi, sivrisineklerde ters genetik için kullanılan ana araçlardan biridir ve oral teslimat, yetişkin sivrisineklerde mikro enjeksiyona gerek kalmadan gen susturmalarını indüklememizi ve sürdürmemizi sağlar. Çift sarmallı RNA'nın yetişkin sivrisineklere oral yoldan verilmesi, gen fonksiyonunu incelemek için çalışmayı, zamanı ve çabayı önemli ölçüde azaltan düşük maliyetli ve çok yönlü bir RNA girişim yöntemidir. Bu yöntem sadece Anopheles gambiae'deki diğer hedef genleri değil, aynı zamanda Anopheles albinamus gibi ilgi çekici başka bir anofelde de çalışmak için kullanılabilir.
Başlamak için, 37 santigrat derece ve 180 RPM'de 12 saat boyunca bir platform çalkalayıcıda ampisilin ve tetrasiklin içeren beş mililitre lb içinde plazmidi eksprese eden çift sarmallı RNA'yı içeren tek bir bakteri kolonisi olan Escherichia coli suşu HT115 (DE3) 'den bir kültür yetiştirin. 12 saat sonra, gece boyunca yetiştirilen bakteri kültürünün 0.5 mililitresini alın ve ampisilin ve tetrasiklin içeren 2X maya tripton ortamında 1000'de bir seyreltme yapın. Çift sarmallı RNA üretimini indüklemek için, 40 mikromolar'ın son konsantrasyonunda IPDG ekleyin.
Daha sonra gösterildiği gibi kültürü sallama koşullarında iki saat boyunca inkübe edin. Kuluçka sonunda, kültürün optik yoğunluğu 600 nanometrede 0.4'e ulaştığında, bakteri hücrelerini dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 4.000 kez G'de merkezlenerek peletleyin ve daha sonra hücreleri bir PBS hacminde yıkayın. Hücreleri bir kez daha döndürdükten sonra, hücreleri PBS'de yeniden askıya alın ve bir saat boyunca 70 santigrat derecede inkübe edin.
Isı bakterileri öldürdükten sonra, 400 mikrolitre hacimli alikotlar yapın ve daha fazla kullanıma kadar 20 santigrat derecede saklayın. Çift sarmallı RNA'yı eksprese eden 400 mikrolitrelik çözülme ısısı öldürücü bakterilerden% 0.2 metilparaben içeren 1.6 mililitre% 12 şeker çözeltisi ile karıştırın. Bu çözeltiye küçük bir pamuk topu batırın ve beş günlük sivrisinekleri içeren bir kafesin içine yerleştirin ve sivrisineklerin bu çözelti üzerinde beslenmesini sağlayın.
Çift sarmallı RNA şeker çözeltisine batırılmış pamuk topunu art arda sekiz gün boyunca her gün değiştirin ve kafesin sabit koşullar altında korunmasını sağlayın. Sivrisinekleri soğukla uyuşturmak için, sivrisinekler hareket etmeyi bırakana kadar kabı buzun üzerine yerleştirin ve daha sonra diseksiyon için dişileri izole etmek için sivrisinekleri soğuk bir yüzeye yerleştirin. Sivrisinekleri etanol ile püskürttükten sonra, PBS ile cam bir yüzeye yerleştirin.
Bir çift forseps ile sivrisinek kafasını sabitleyin ve toraksı çok yavaş bir şekilde çekerek tükürük bezlerinin PBS'ye salınmasına izin verin. Tükürük bezleri 10 sivrisinek diseke edildikten sonra, RNA ekstraksiyonu için bezleri çekin. RNA ekstraksiyonunun tamamlanmasının ardından, RNA peletini 30 mikrolitre RNA serbest suda askıya alın.
Absorbansı ölçün ve metin yazısında açıklandığı gibi RNA konsantrasyonunu hesaplayın. Ticari bir ters transkripsiyon kiti kullanarak, bir mikrogram RNA'dan cDNA'yı sentezleyin. cDNA'yı 10 kez seyreltin ve RTPCR reaksiyonlarını üreticinin tavsiyelerine göre hedef ve temizlik genleri için üçlü olarak ayarlayın.
CDNA'yı standart gerçek zamanlı PCR koşullarıyla güçlendirin. Kan besleme yeteneğini değerlendirmek için, hedef ile tedavi edilen ve çift sarmallı RNA'yı kontrol eden 15 dişi sivrisinek grubunu küçük kafeslere yerleştirin ve dört saat boyunca aç bırakın. 37 santigrat dereceye ayarlanmış dolaşımdaki bir su banyosu, cam sivrisinek besleyiciler ve peryfill membranı kullanarak sivrisineklere defibrillenmiş ucuz kan sağlayın.
Her gruba tamamen dahil olmak için ilk beş dişiden başarılı bir şekilde kan unu elde etmek için yapılan sondalama girişimlerinin sayısını gözlemleyin, sayın ve kaydedin. Taze dokuyu izole ettikten ve PBS daha önce gösterdikten sonra, 90 saniye boyunca buz gibi soğuk asetonda sabitleyin. Daha sonra dokuyu PBS'de birkaç kez durulayın ve PBS'de seyreltilmiş anti-serum ile dört santigrat derecede gece boyunca birincil antikorlarla inkübe edin.
Kuluçka sonunda, dokuyu PBS ile birkaç kez yıkayın. PBS'de seyreltilmiş floresan ikincil antikorları ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. İki saatlik inkübasyonun bitiminden 30 dakika önce herhangi bir karşı leke ekleyin.
İki saat sonra, dokuyu PBS ile üç kez yıkayın, ardından dokuları% 100 gliserol içinde, bir milimetre kalınlığında bir kapak kayması ile standart bir mikroskop sürgüsü üzerine monte edin ve görüntülemeye kadar 20 santigrat derecede saklayın. Mikro aray ekspresyon verileri, yetişkin tükürük bezlerinde seçilen tüm hedeflenmiş genlerin ekspresyonunu gösterdi ve AAPP ve adaçayı seviyeleri özellikle yüksekti. Çift sarmallı RNA, tükürük bezindeki çatal başı transkriptlerinin bolluğunu etkili bir şekilde azalttı.
Çatal başlı çift sarmallı RNA ile beslenen sivrisinekler, kontrol grubundan veya FEG çift cinsiyetli çift sarmallı RNA beslenen sivrisineklerden beş kat daha fazla beslenme girişimi sergiledi. Adaçayı ve CrebA boyama seviyeleri, çatal başı RNA girişimini takiben tüm tükürük bezi loblarında, karınca kontrol RNA girişimine kıyasla belirgin şekilde azalmıştır. Çok bol tükürük bileşeni proteinleri göz önüne alındığında, çatal başı RNA girişimini takiben her üç tükürük bezi lobunda da AAPP seviyeleri, kontrol RNA girişim tedavisine kıyasla azaltılmıştır.
Öte yandan, müsin seviyelerinde herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Bu veriler, çatal kafasının farklı tükürük protein genlerinin ekspresyonuna farklı şekilde katkıda bulunduğunu göstermektedir. Çatal başı RNA girişim tedavisini takiben distal lateral loblarda azalmış Rab11 floresansı gözlendi, ancak medial ve proksimal lateral loblarda Rab11 sinyalinde artış da meydana geldi.
Çatal başı RNA girişiminden sonra Nil Kırmızısı sinyalinde, kontrol RNA girişim tedavisine kıyasla fark edilebilir bir fark gözlenmedi. Bazı sekreter makine reaksiyonu, tükürük bezi lobları arasında farklılık gösteren karmaşık bir şekilde. Bu teknik, araştırmacıların ekspresyonun tek bir çift sarmallı RNA enjeksiyonu ile azaltılabileceği genleri susturmalarına ve RNAi'yi potansiyel bir vektör kontrol yöntemi olarak kullanmak için çift sarmallı RNA'nın oral dağıtımını keşfetmelerine izin verebilir.
