РНК-интерференция является одним из основных инструментов, используемых для обратной генетики у комаров, а оральная доставка позволяет нам индуцировать и поддерживать глушение генов у взрослых комаров без необходимости микроинъекции. Пероральная доставка двухцепочечной РНК взрослым комарам является недорогим и универсальным методом интерференции РНК, который значительно сокращает работу, время и усилия по изучению функции генов. Этот метод может быть использован для изучения не только других генов-мишеней в Anopheles gambiae, но и в других анофелях, представляющих интерес, таких как Anopheles albinamus.
Для начала вырастите культуру из одной бактериальной колонии штамма Escherichia coli HT115(DE3), содержащую двухцепочечную РНК-экспрессирующую плазмиду в пяти миллилитрах фунта, содержащего ампициллин и тетрациклин, на платформенном шейкере в течение 12 часов при 37 градусах Цельсия и 180 об/мин. Через 12 часов возьмите 0,5 миллилитра выращенной на ночь бактериальной культуры и сделайте одно из 1000 разведения в 2X дрожжевой триптоновой среде, содержащей ампициллин и тетрациклин. Чтобы индуцировать двухцепочечную продукцию РНК, добавляют IPDG в конечной концентрации 40 микромоляров.
Затем инкубируйте культуру в течение двух часов в условиях встряхивания, как показано. В конце инкубации, когда оптическая плотность культуры достигает 0,4 при 600 нанометрах, гранулируют бактериальные клетки путем центрификации в 4000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и затем промывают клетки в одном объеме PBS. После еще одного вращения клеток повторно суспендируют клетки в PBS и инкубируют при 70 градусах Цельсия в течение одного часа.
После того, как тепло убивает бактерии, сделайте аликвоты объемом 400 микролитров и храните их при 20 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Смешайте одну 400-микролитровую аликвоту оттаивающих тепло убитых бактерий, экспрессирующих двухцепочечную РНК, с 1,6 миллилитрами 12%-го раствора сахара, содержащего 0,2%метилпарабена. Замочите небольшой ватный тампон в этом растворе и поместите его в клетку, содержащую пятидневных комаров, и убедитесь, что комары питаются этим раствором.
Меняйте ватный тампон, смоченный в двухцепочечном растворе РНК-сахара, через день в течение восьми дней подряд, гарантируя, что клетка поддерживается в постоянных условиях. Чтобы обезболить комаров холодом, поместите контейнер на лед до тех пор, пока комары не перестанут двигаться, а затем поместите комаров на холодную поверхность, чтобы изолировать самок для рассечения. После опрыскивания комаров этанолом поместите их на стеклянную поверхность с PBS.
С помощью пары щипцов закрепите голову комара и очень медленно потяните грудную клетку, позволяя слюнным железам высвобождаться в PBS. Как только слюнные железы будут рассечены от 10 комаров, вытяните железы для извлечения РНК. По завершении экстракции РНК приостановить гранулу РНК в 30 микролитрах свободной воды РНК.
Измерьте поглощение и рассчитайте концентрацию РНК, как описано в тексте рукописи. Используя коммерческий набор обратной транскрипции, синтезируйте кДНК из одного микрограмма РНК. Разбавьте кДНК в 10 раз и настройте реакции RTPCR в трех экземплярах для генов-мишеней и ведения хозяйства в соответствии с рекомендациями производителя.
Амплируйте CDNA стандартными условиями ПЦР в режиме реального времени. Чтобы оценить способность к кровавому питанию, поместите группы из 15 самок комаров, обработанных целевой и контролируемой двухцепочечной РНК, в небольшие клетки и морите их голодом в течение четырех часов. Обеспечьте дефибрилированную дешевую кровь комарам с помощью циркуляционной водяной бани, установленной до 37 градусов по Цельсию, стеклянных кормушек для комаров и мембраны для заполнения.
Наблюдайте, подсчитывайте и записывайте количество пробных попыток успешно получить кровяную муку от первых пяти самок, чтобы полностью набухнуть в каждой группе. После выделения свежей ткани, которую PBS продемонстрировал ранее, зафиксируйте ее в ледяном ацетоне в течение 90 секунд. Затем промыть ткань несколько раз в PBS и инкубировать с первичными антителами в течение ночи при четырех градусах Цельсия с антисывороткой, разведенной в PBS.
В конце инкубации промыть ткань несколько раз ПБС. Добавляют флуоресцентные вторичные антитела, разведенные в PBS, и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение двух часов. Добавьте любое встречное пятно за 30 минут до окончания двухчасовой инкубации.
Через два часа промыть ткань три раза PBS, затем установить ткани в 100% глицерине на стандартный слайд микроскопа с крышкой толщиной в один миллиметр и хранить при 20 градусах Цельсия до получения изображения. Данные экспрессии микроарай показали экспрессию всех выбранных целевых генов во взрослых слюнных железах, а уровни AAPP и шалфея были особенно высокими. Двухцепочечная РНК эффективно уменьшала обилие транскриптов головки вилки в слюнной железе.
Двухцепочечные РНК-комары, питаемые вилочной головкой, демонстрировали в пять раз больше попыток кормления, чем контрольная группа или двухцепочечная РНК FEG, которых кормили комаров, чтобы они были полностью нагружены кровью. Уровни окрашивания шалфея и CrebA были заметно снижены во всех долях слюнных желез после интерференции РНК головки вилки по сравнению с интерференцией РНК контроля муравьев. При рассмотрении высокообильных белков компонентов слюны уровни AAPP были снижены во всех трех долях слюнных желез после интерференции РНК головки вилки по сравнению с контрольной РНК-интерференцией.
С другой стороны, никаких изменений в уровнях муцина не наблюдалось. Эти данные свидетельствуют о том, что головка вилки по-разному способствует экспрессии различных генов белка слюны. Снижение флуоресценции Rab11 наблюдалось в дистальных боковых долях после интерференции РНК головки вилки, однако также наблюдалось увеличение сигнала Rab11 в медиальной и проксимальной боковых долях.
Не наблюдалось заметной разницы в сигнале Nile Red после РНК-интерференции головки вилки по сравнению с контрольной РНК-интерференцией. некоторые секретари машинной реакции сложным образом, который отличается между долями слюнных желез. Этот метод может позволить исследователям заставить замолчать гены, экспрессия которых может быть уменьшена путем одной инъекции двухцепочечной РНК, и исследовать пероральную доставку двухцепочечной РНК для использования РНК в качестве потенциального метода борьбы с переносчиками.
