RNA-Interferenz ist eines der Hauptwerkzeuge, die für die umgekehrte Genetik bei Moskitos verwendet werden, und die orale Verabreichung ermöglicht es uns, das Gen-Silencing bei erwachsenen Moskitos zu induzieren und aufrechtzuerhalten, ohne dass eine Mikroinjektion erforderlich ist. Die orale Verabreichung von Doppelstrang-RNA an erwachsene Moskitos ist eine kostengünstige und vielseitige RNA-Interferenzmethode, die den Arbeitsaufwand und die Zeit und den Aufwand für die Untersuchung der Genfunktion erheblich reduziert. Diese Methode könnte verwendet werden, um nicht nur andere Zielgene in Anopheles gambiae, sondern auch in anderen Anopheles von Interesse wie Anopheles albinamus zu untersuchen.
Züchten Sie zunächst eine Kultur aus einer einzigen Bakterienkolonie des Escherichia coli-Stammes HT115 (DE3), die die doppelsträngige RNA enthält, die Plasmid in fünf Millilitern lb mit Ampicillin und Tetracyclin exprimiert, auf einem Plattformschüttler für 12 Stunden bei 37 Grad Celsius und 180 U / min. Nehmen Sie nach 12 Stunden 0,5 Milliliter der über Nacht gewachsenen Bakterienkultur und machen Sie eine Verdünnung von eins zu 1000 in 2X Hef-Trypton-Medien, die Ampicillin und Tetracyclin enthalten. Um die doppelsträngige RNA-Produktion zu induzieren, fügen Sie IPDG in der Endkonzentration von 40 Mikromolaren hinzu.
Dann inkubieren Sie die Kultur für zwei Stunden unter Schüttelbedingungen, wie gezeigt. Am Ende der Inkubation, wenn die optische Dichte der Kultur 0,4 bei 600 Nanometern erreicht, pelletieren Sie die Bakterienzellen durch Zentrifikation bei 4.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und waschen Sie dann die Zellen in einem PBS-Volumen. Nachdem Sie die Zellen noch einmal gedreht haben, suspendieren Sie die Zellen in PBS und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 70 Grad Celsius.
Nach dem Abtöten der Bakterien Aliquots mit einem Volumen von 400 Mikrolitern herstellen und bis zur weiteren Verwendung bei 20 Grad Celsius lagern. Mischen Sie einen 400 Mikroliter Aliquot Tauhitze abgetötete Bakterien, die doppelsträngige RNA exprimieren, mit 1,6 Millilitern 12%Zuckerlösung, die 0,2%Methylparaben enthält. Tränken Sie einen kleinen Wattebausch in diese Lösung und legen Sie ihn in einen Käfig mit fünf Tage alten Moskitos und stellen Sie sicher, dass sich die Moskitos von dieser Lösung ernähren.
Wechseln Sie den Wattebausch, der in doppelsträngiger RNA-Zuckerlösung getränkt ist, jeden zweiten Tag an acht aufeinanderfolgenden Tagen, um sicherzustellen, dass der Käfig unter konstanten Bedingungen gehalten wird. Um die Moskitos mit Kälte zu betäuben, stellen Sie den Behälter auf Eis, bis sich die Moskitos nicht mehr bewegen, und legen Sie die Moskitos dann auf eine kalte Oberfläche, um Weibchen zur Dissektion zu isolieren. Nachdem Sie die Moskitos mit Ethanol besprüht haben, legen Sie sie mit PBS auf eine Glasoberfläche.
Sichern Sie mit einer Pinzette den Mückenkopf und ziehen Sie den Thorax sehr langsam, so dass die Speicheldrüsen in PBS freigesetzt werden können. Sobald die Speicheldrüsen aus 10 Moskitos seziert sind, ziehen Sie die Drüsen zur RNA-Extraktion. Nach Abschluss der RNA-Extraktion suspendieren Sie das RNA-Pellet in 30 Mikrolitern RNA-freiem Wasser.
Messen Sie die Absorption und berechnen Sie die RNA-Konzentration wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie ein kommerzielles Reverse-Transkriptionskit, synthetisieren Sie cDNA aus einem Mikrogramm RNA. Verdünnen Sie die cDNA 10 Mal und richten Sie die RTPCR-Reaktionen in Triplikaten für Ziel- und Housekeeping-Gene gemäß den Empfehlungen des Herstellers ein.
Amplifizieren Sie die CDNA mit Standard-Echtzeit-PCR-Bedingungen. Um die Fähigkeit zur Bluternährung zu bewerten, legen Sie Gruppen von 15 weiblichen Moskitos, die mit Ziel- und kontrollierter doppelsträngiger RNA behandelt wurden, in kleine Käfige und verhungern sie für vier Stunden. Versorgen Sie die Moskitos mit defibrilliertem billigem Blut über ein zirkulierendes Wasserbad, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, Glasmückenfresser und Peryfill-Membran.
Beobachten, zählen und zeichnen Sie die Anzahl der Sondierungsversuche auf, um erfolgreich eine Blutmahlzeit von den ersten fünf Frauen zu erhalten, um in jeder Gruppe vollständig verstopft zu werden. Nachdem Sie frisches Gewebe isoliert und PBS zuvor gezeigt haben, fixieren Sie es 90 Sekunden lang in eiskaltem Aceton. Dann spülen Sie das Gewebe mehrmals in PBS und inkubieren Sie mit primären Antikörpern über Nacht bei vier Grad Celsius mit Anti-Serum, das in PBS verdünnt wird.
Waschen Sie das Gewebe am Ende der Inkubation mehrmals mit PBS. Fügen Sie fluoreszierende sekundäre Antikörper hinzu, die in PBS verdünnt sind, und inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Fügen Sie einen beliebigen Zählerfleck 30 Minuten vor dem Ende der zweistündigen Inkubation hinzu.
Nach zwei Stunden das Gewebe dreimal mit PBS waschen, dann das Gewebe in 100% Glycerin auf einem Standard-Objektträger mit einem einen Millimeter dicken Deckslip montieren und bis zur Bildgebung bei 20 Grad Celsius lagern. Die Mikro-Aray-Expressionsdaten zeigten die Expression aller ausgewählten Zielgene in erwachsenen Speicheldrüsen und die Spiegel von AAPP und Salbei waren besonders hoch. Die doppelsträngige RNA reduzierte effektiv die Häufigkeit von Gabelkopftranskripten in der Speicheldrüse.
Die mit doppelsträngiger RNA gefütterten Moskitos mit Gabelkopf zeigten fünfmal mehr Fütterungsversuche als die Kontrollgruppe oder FEG doppelsexuell doppelsträngige RNA-gefütterte Moskitos, die vollständig mit Blut gefüllt waren. Die Konzentrationen der Salbei- und CrebA-Färbung waren in allen Speicheldrüsenlappen nach einer Gabelkopf-RNA-Interferenz im Vergleich zur Ameisenkontroll-RNA-Interferenz deutlich reduziert. Unter Berücksichtigung von hochreichlich vorhandenen Speichelkomponentenproteinen waren die AAPP-Spiegel in allen drei Speicheldrüsenlappen nach einer Gabelkopf-RNA-Interferenz im Vergleich zur Kontroll-RNA-Interferenzbehandlung reduziert.
Auf der anderen Seite wurden keine Veränderungen des Mucinspiegels beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass der Gabelkopf unterschiedlich zur Expression verschiedener Speichelproteingene beiträgt. Eine verminderte Rab11-Fluoreszenz wurde in distalen Seitenlappen nach einer RNA-Interferenzbehandlung mit dem Gabelkopf beobachtet, jedoch trat auch ein erhöhtes Rab11-Signal in den medialen und proximalen Seitenlappen auf.
Es wurde kein erkennbarer Unterschied im Nil-Rot-Signal nach Gabelkopf-RNA-Interferenz im Vergleich zur Kontroll-RNA-Interferenzbehandlung beobachtet. Einige Sekretärinnenmaschinen reagieren auf komplexe Weise, die sich zwischen Speicheldrüsenlappen unterscheidet. Diese Technik könnte es den Forschern ermöglichen, Gene zum Schweigen zu bringen, für die die Expression durch eine einzige Injektion von Doppelstrang-RNA reduziert werden kann, und die orale Verabreichung von Doppelstrang-RNA zu untersuchen, um RNAi als potenzielle Vektorkontrollmethode zu verwenden.
