ADH 및 FAD는 상이한 여기 및 방출 파장에서 자가형광을 나타내는 내인성 분자이다. 대사 반응의 보조 효소로서의 사용 때문에, 자기 형광 현미경은 세포 신진 대사를 평가할 수 있습니다. NADH 및 FAD의 자가형광 이미징은 외인성 표지를 필요로 하지 않으며 세포하 분해능을 갖는 비파괴적인 방법이다.
자가 형광 현미경 검사는 살아있는 샘플 및 시간 과정 연구에 사용할 수 있습니다. 자가형광 영상은 임의의 살아있는 세포 또는 조직에 광범위하게 적용될 수 있다. 자가형광 영상은 뉴런, 암세포, 종양, 생체내, 줄기세포 및 면역세포에 사용되어 왔다.
이 절차를 시연하는 것은 Texas A & M University의 Quantitative Optical Imaging Laboratory의 대학원생 인 Linghao Hu가 될 것입니다. 레이저 소스 및 검출기를 포함한 다중 광자 형광 수명 현미경의 모든 성분을 켜서 실험을 시작하십시오. 샘플 배치 전에 밝은 필드 램프를 켜고 빛이 아이피스로 들어가는지 확인하십시오.
그런 다음 세포 이미징에 대한 목표를 선택합니다. 공기 목표를 사용하지 않는 경우 목표 위에 적절한 침지 매체 한 방울을 바르십시오. 유리 바닥 접시를 현미경 단계의 샘플 홀더 위에 놓습니다.
그런 다음 X/Y 스테이지 컨트롤을 사용하여 시편을 목표물로 중앙에 배치하여 시편이 고정되어 있고 이미징 중에 움직이지 않는지 확인하십시오. 완료되면 아이피스를보고 목표를 위로 움직여 세포에 초점을 맞 춥니 다. 현미경이 인클로저 내에 있으면 라이트 박스 도어를 닫으십시오.
그런 다음 이미지 획득 소프트웨어를 열고 다중 광자 이미징 탭을 클릭하여 원고에 설명 된대로 다중 광자 이미징 매개 변수를 설정하십시오. 검출기의 이득을 형광 수명 이미징 또는 FILM을 위한 최적 값으로 조정한다. 그런 다음 시편의 각 픽셀에서 레이저 지출의 체류 시간을 원하는 값으로 변경하십시오.
니코틴아미드 아데닌 포스페이트 디뉴클레오타이드 또는 NADPH의 경우 다중 광자 레이저를 750나노미터로 설정합니다. 그런 다음 레이저의 셔터를 열 때 셀이 손상되지 않도록 레이저의 전원 제어가 0으로 설정되어 있는지 확인합니다. 방출 필터를 400 ~ 500 나노미터로 설정합니다.
매개 변수가 설정되면 초점 또는 라이브 뷰 방식으로 이미징을 시작하여 이미지 설정을 최적화합니다. 레이저 파워를 세 밀리와트에서 여덟 밀리와트로 천천히 증가시키면서 셀에 초점을 맞춥니다. 조정이 완료되면 사용 된 최대 전력을 기록하십시오.
Petri 접시의 다른 세그먼트에서 이미징을 위해 기록 된 최대 전원 설정을 사용하십시오. 60초의 이미지 적분 시간을 갖는 NADPH-FILM 이미지를 수집하고, 이미지가 형광 수명 붕괴 곡선 내에서 세포질 픽셀에 대해 100 광자의 피크와 같은 충분한 수의 광자를 가지고 있는지 확인한다. 광자의 수가 너무 적으면 레이저 전력 또는 이미지 획득 기간을 늘리십시오.
플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 또는 FAD 이미징의 경우, 다중 광자 레이저를 890나노미터로 설정하고 레이저가 새로운 파장에서 모드 잠금을 기다릴 때까지 기다립니다. 레이저의 전원 제어가 처음에 0으로 설정되어 있는지 확인하십시오. 방출 필터를 500 ~ 600나노미터로 설정합니다.
이미지 설정을 최적화하려면 레이저 전력을 5~10밀리와트로 늘리고 사용된 최대 전력을 기록하여 초점 또는 라이브 뷰 방식으로 이미징을 시작합니다. 후속 시야각의 FAD 이미징에 동일한 전원 설정을 사용합니다. 60초의 이미지 통합 시간을 갖는 FAD-FILM 이미지를 수집하고 이미지가 형광 수명 감쇠 곡선 내에 충분한 광자를 가지고 있는지 확인하십시오.
광자 수가 너무 적으면 레이저 파워나 이미지 획득 지속 시간을 늘리고 각 이미지가 두 FOV에서 떨어져 있는 상태에서 추가로 네 개에서 다섯 개의 시야각 또는 FOV에 대해 이미징을 반복합니다. 80 밀리몰 시안화 나트륨 용액을 만들려면 130.24 밀리그램의 시안화 나트륨을 PBS 25 밀리리터에 녹입니다. 배양 접시로부터, 100 마이크로리터의 배양 배지를 흡인물로 100 마이크로리터의 시안화 나트륨 용액으로 대체하여 접시 중의 시안화물의 4밀리몰 농도를 얻었다.
세포를 다섯 분 동안 인큐베이터에 넣어 세포가 시안화물 용액과 반응하도록 한다. 시안화물 노출 후, 앞서 기술한 바와 같이 세포의 NADPH 및 FAD 이미지를 획득한다. 이 연구는 요소로부터 측정된 계기 반응 함수 또는 IRF를 사용하여 형광 수명 파라미터를 계산하였다.
파라미터는 세그멘테이션에 사용된 각 세포의 세포질의 픽셀에 걸쳐 평균화되었다. 배경 소음을 제거하기 위해 개별 세포를 확인하고 마스킹했습니다. 그런 다음, 핵을 확인하고 세포 마스크 상에 투사하였다.
또한, 세포를 여과하여 전형적인 세포의 크기에 맞지 않는 마스킹된 영역을 제거하였다. NADPH와 FAD의 다중 광자 형광 수명 이미징은 시안화물 처리 전후의 세포 형태학 및 대사의 시각화를 가능하게했습니다. NADPH 수명은 시안화물 처리로 감소하는 반면, FAD 수명은 시안화물 처리 후 증가하는 것으로 관찰되었다.
대표적인 박스 플롯은 시아나이드 처리 후 MCF7 세포의 광학 산화환원 비율이 감소했음을 나타내었다. 시안화물 노출은 MCF7 세포의 진폭 가중 NADPH 수명을 감소시켰다. 짧고 긴 수명은 NADPH의 경우 감소했지만 NADPH의 경우 알파 수명이 증가했습니다.
FAD의 경우, MCF7 세포의 진폭 가중 수명은 시안화물 노출 후 증가했다. FAD의 경우 짧은 수명과 긴 수명이 모두 증가했지만 FAD 알파의 경우 감소했습니다. 샘플에 충분한 레이저 파워를 갖는 것이 중요하지만, 너무 많은 전력은 세포에 손상을 줄 수 있음을 기억하십시오.
자가형광 이미징은 세포에 손상을 주지 않기 때문에, 후속 생화학적 분석은 동일한 샘플에 사용될 수 있다.
