L’ADH et la FAD sont des molécules endogènes qui présentent une autofluorescence à différentes longueurs d’onde d’excitation et d’émission. En raison de leur utilisation comme co-enzymes des réactions métaboliques, la microscopie à autofluorescence peut évaluer le métabolisme cellulaire. L’imagerie par autofluorescence du NADH et du FAD ne nécessite pas d’étiquettes exogènes et est une méthode non destructive avec une résolution subcellulaire.
La microscopie à autofluorescence peut être utilisée sur des échantillons vivants et pour des études de parcours temporel. L’imagerie autofluorescente peut être largement appliquée à toutes les cellules ou tissus vivants. L’imagerie autofluorescente a été utilisée sur les neurones, les cellules cancéreuses, les tumeurs, in vivo, les cellules souches et les cellules immunitaires.
La démonstration de la procédure sera faite par Linghao Hu, un étudiant diplômé du laboratoire d’imagerie optique quantitative de la Texas A & M University. Commencez l’expérience en allumant tous les composants du microscope à vie à fluorescence multiphotonique, y compris la source laser et les détecteurs. Avant de placer l’échantillon, allumez la lampe à champ lumineux et assurez-vous que la lumière pénètre dans l’oculaire.
Ensuite, choisissez un objectif pour l’imagerie cellulaire. Si vous n’utilisez pas d’objectif aérien, appliquez une goutte du milieu d’immersion approprié sur le dessus de l’objectif. Placez le plat à fond de verre sur le porte-échantillon sur la scène du microscope.
Ensuite, centrez l’échantillon avec l’objectif à l’aide de la commande d’étage X / Y Assurez-vous que l’échantillon est sécurisé et ne bougera pas pendant l’imagerie. Une fois cela fait, regardez dans l’oculaire et déplacez l’objectif vers le haut pour vous concentrer sur les cellules. Si le microscope se trouve dans un boîtier, fermez la porte de la boîte à lumière.
Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et cliquez sur l’onglet Imagerie multiphotonique pour définir les paramètres d’imagerie multiphotoniques comme décrit dans le manuscrit. Ajustez le gain du détecteur à la valeur optimale pour l’imagerie à vie de fluorescence, ou FILM. Ensuite, modifiez le temps de séjour de la dépense laser à chaque pixel de l’échantillon à la valeur souhaitée.
Pour le nicotinamide adénine phosphate dinucléotide, ou NADPH, réglez le laser multiphoton à 750 nanomètres. Ensuite, vérifiez que le contrôle de puissance du laser est réglé à zéro afin que les cellules ne soient pas endommagées lors de l’ouverture de l’obturateur sur le laser. Réglez un filtre d’émission entre 400 et 500 nanomètres.
Lorsque les paramètres sont définis, commencez à créer des images de manière ciblée ou en direct pour optimiser les paramètres de l’image. Augmentez lentement la puissance du laser de trois à huit milliwatts tout en vous assurant que les cellules sont au point. Une fois réglé, notez la puissance maximale utilisée.
Utilisez le réglage de puissance maximale enregistrée pour l’imagerie sur d’autres segments de la boîte de Pétri. Collectez une image NADPH-FILM avec un temps d’intégration d’image de 60 secondes et vérifiez que l’image a un nombre suffisant de photons, comme un pic de 100 photons pour un pixel de cytoplasme dans la courbe de désintégration de la durée de vie de la fluorescence. Si le nombre de photons est trop faible, augmentez la puissance laser ou la durée d’acquisition de l’image.
Pour l’imagerie du dinucléotide de flavine adénine, ou FAD, réglez le laser multiphoton à 890 nanomètres et attendez que le laser se verrouille en mode à la nouvelle longueur d’onde. Assurez-vous que le contrôle de puissance du laser est initialement réglé à zéro. Réglez un filtre d’émission entre 500 et 600 nanomètres.
Pour optimiser les paramètres d’image, commencez à photographier de manière focalisée ou en direct en augmentant la puissance du laser à 5 à 10 milliwatts et en enregistrant la puissance maximale utilisée. Utilisez le même paramètre d’alimentation pour l’imagerie FAD des champs de vision suivants. Collectez l’image FAD-FILM avec un temps d’intégration de l’image de 60 secondes et vérifiez que l’image contient suffisamment de photons dans la courbe de désintégration de la durée de vie de la fluorescence.
Si le nombre de photons est trop faible, augmentez la puissance laser ou la durée d’acquisition de l’image et répétez l’imagerie pour quatre à cinq champs de vision supplémentaires, ou FOV, chaque image étant espacée de deux FOV. Pour obtenir une solution de cyanure de sodium de 80 millimolaires, dissoudre 130,24 milligrammes de cyanure de sodium dans 25 millilitres de PBS. À partir de la boîte de culture, aspirer 100 microlitres de milieu de culture à remplacer par 100 microlitres de solution de cyanure de sodium pour obtenir une concentration de cyanure de quatre millimolaires dans la boîte.
Mettez les cellules dans un incubateur pendant cinq minutes pour permettre aux cellules de réagir avec la solution de cyanure. Après l’exposition au cyanure, acquérir des images NADPH et FAD des cellules comme décrit précédemment. L’étude a calculé les paramètres de durée de vie de la fluorescence à l’aide de la fonction de réponse de l’instrument mesurée, ou IRF, à partir de l’urée.
Les paramètres ont été moyennés à travers les pixels du cytoplasme de chaque cellule utilisée pour la segmentation. Des cellules individuelles ont été identifiées et masquées pour éliminer le bruit de fond. Ensuite, le noyau a été identifié et projeté sur le masque cellulaire.
De plus, les cellules ont été filtrées pour éliminer les zones masquées qui ne correspondent pas à la taille des cellules typiques. L’imagerie à vie de fluorescence multiphotonique du NADPH et du FAD a permis de visualiser la morphologie et le métabolisme cellulaires avant et après le traitement au cyanure. Il a été observé que la durée de vie du NADPH diminue avec le traitement au cyanure, tandis que la durée de vie de la DCP augmente après le traitement au cyanure.
Le diagramme représentatif de la boîte indiquait que le rapport redox optique des cellules MCF7 diminuait après le traitement au cyanure. L’exposition au cyanure a diminué la durée de vie du NADPH pondérée en amplitude des cellules MCF7. Les durées de vie courtes et longues ont diminué pour le NADPH, mais ont augmenté pour le NADPH alpha un.
Pour la DCP, la durée de vie pondérée en fonction de l’amplitude des cellules MCF7 a augmenté après l’exposition au cyanure. Les durées de vie courtes et longues ont augmenté pour FAD, mais ont diminué pour FAD alpha one. Il est important d’avoir suffisamment de puissance laser pour aller aux échantillons, mais rappelez-vous, trop de puissance peut causer des dommages aux cellules.
Parce que l’imagerie par autofluorescence n’endommage pas les cellules, des tests biochimiques ultérieurs peuvent être utilisés sur les mêmes échantillons.
