АДГ и ФАД являются эндогенными молекулами, которые проявляют автофлуоресценцию при различных длинах волн возбуждения и излучения. Из-за их использования в качестве коферментов метаболических реакций, автофлуоресцентная микроскопия может оценить клеточный метаболизм. Автофлуоресцентная визуализация NADH и FAD не требует экзогенных меток и является неразрушающим методом с субклеточным разрешением.
Автофлуоресцентная микроскопия может быть использована на живых образцах и для изучения времени курса. Автофлуоресцентная визуализация может широко применяться к любым живым клеткам или тканям. Аутофлуоресцентная визуализация использовалась на нейронах, раковых клетках, опухолях, in-vivo, стволовых клетках и иммунных клетках.
Продемонстрировать процедуру будет Лингхао Ху, аспирант лаборатории количественной оптической визуализации в Техасском университете A & M. Начните эксперимент с включения всех компонентов многофотонного флуоресцентного микроскопа, включая лазерный источник и детекторы. Перед размещением образца включите яркую полевую лампу и убедитесь, что свет попадает в окуляр.
Затем выберите цель для визуализации клеток. Если не используется воздушный объектив, нанесите одну каплю соответствующей погружной среды поверх объектива. Поместите стеклянную тарелку на держатель для образцов на ступеньке микроскопа.
Затем центрируйте образец с целью с помощью управления ступени X / Y Убедитесь, что образец закреплен и не будет двигаться во время визуализации. Как только это будет сделано, загляните в окуляр и переместите цель вверх, чтобы сосредоточиться на клетках. Если микроскоп находится в корпусе, закройте дверцу светового короба.
Затем откройте программное обеспечение для получения изображений и перейдите на вкладку «Многофотонная визуализация», чтобы задать параметры многофотонной визуализации, как описано в рукописи. Отрегулируйте коэффициент усиления детектора до оптимального значения для флуоресцентной визуализации в течение всего срока службы или FILM. Затем измените время ожидания лазерного расхода на каждый пиксель образца на желаемое значение.
Для динуклеотида никотинамидаденинфосфата, или NADPH, установите многофотонный лазер на 750 нанометров. Затем убедитесь, что управление мощностью для лазера установлено на нуле, чтобы ячейки не были повреждены при открытии затвора на лазере. Установите эмиссионный фильтр на расстоянии от 400 до 500 нанометров.
Когда параметры заданы, начните съемку в режиме фокусировки или просмотра в реальном времени, чтобы оптимизировать параметры изображения. Медленно увеличивайте мощность лазера с трех до восьми милливатт, гарантируя, что клетки находятся в фокусе. После настройки запишите максимальную используемую мощность.
Используйте записанную максимальную настройку мощности для визуализации на других сегментах чашки Петри. Соберите изображение NADPH-FILM со временем интеграции изображения 60 секунд и проверьте, что изображение имеет достаточное количество фотонов, таких как пик в 100 фотонов для пикселя цитоплазмы в пределах кривой распада времени флуоресценции. Если количество фотонов слишком мало, увеличьте мощность лазера или продолжительность получения изображения.
Для визуализации флавинадениндинуклеотида, или FAD, установите многофотонный лазер на 890 нанометров и подождите, пока лазер зафиксирует режим на новой длине волны. Убедитесь, что управление мощностью лазера изначально установлено на нулевом уровне. Установите эмиссионный фильтр на частоту от 500 до 600 нанометров.
Чтобы оптимизировать настройки изображения, начните съемку в режиме фокусировки или в режиме реального времени, увеличив мощность лазера до 5-10 милливатт и записав максимальную используемую мощность. Используйте ту же настройку питания для FAD-визуализации последующих полей зрения. Соберите изображение FAD-FILM со временем интеграции изображения 60 секунд и убедитесь, что изображение имеет достаточное количество фотонов в пределах кривой распада срока службы флуоресценции.
Если количество фотонов слишком мало, увеличьте мощность лазера или продолжительность получения изображения и повторите изображение для дополнительных четырех-пяти полей зрения или FOV, при этом каждое изображение будет расположено на расстоянии двух FOV. Чтобы сделать 80-миллимолярный раствор цианида натрия, растворите 130,24 миллиграмма цианида натрия в 25 миллилитрах PBS. Из чашки для культивирования аспирируют 100 микролитров питательной среды заменить 100 микролитрами раствора цианида натрия для получения четырехмиллимолярной концентрации цианида в посуде.
Поместите клетки в инкубатор на пять минут, чтобы клетки могли вступить в реакцию с раствором цианида. После воздействия цианида получите изображения NADPH и FAD клеток, как описано ранее. Исследование рассчитало параметры времени жизни флуоресценции, используя измеренную функцию отклика прибора, или IRF, из мочевины.
Параметры были усреднены по пикселям цитоплазмы каждой клетки, используемой для сегментации. Отдельные клетки были идентифицированы и замаскированы для устранения фонового шума. Затем ядро было идентифицировано и спроецировано на клеточную маску.
Кроме того, клетки были отфильтрованы для удаления маскированных областей, которые не соответствуют размеру типичных клеток. Многофотонная флуоресцентная пожизненная визуализация NADPH и FAD позволила визуализировать морфологию и метаболизм клеток до и после лечения цианидом. Было отмечено, что продолжительность жизни NADPH уменьшается при лечении цианидом, тогда как продолжительность жизни FAD увеличивается после обработки цианидом.
Репрезентативный график коробки показал, что оптическое окислительно-восстановительное соотношение клеток MCF7 уменьшилось после обработки цианидом. Воздействие цианида уменьшало взвешенное по амплитуде время жизни NADPH клеток MCF7. Короткое и длительное время жизни уменьшилось для NADPH, но увеличилось для NADPH альфа-один.
Для FAD амплитудно-взвешенное время жизни клеток MCF7 увеличилось после воздействия цианида. Как короткое, так и длительное время жизни увеличилось для FAD, но уменьшилось для FAD альфа-один. Важно иметь достаточно мощности лазера, идущего к образцам, но помните, что слишком большая мощность может привести к повреждению клеток.
Поскольку автофлуоресцентная визуализация не повреждает клетки, последующие биохимические анализы могут быть использованы на тех же образцах.
