ADH ו-FAD הן מולקולות אנדוגניות המציגות זרימה אוטומטית באורכי גל שונים של עירור ופליטה. בגלל השימוש שלהם כקו-אנזימים של תגובות מטבוליות, מיקרוסקופיה autofluorescence יכול להעריך את חילוף החומרים התאי. הדמיה אוטופלואורסצנטית של NADH ו- FAD אינה דורשת תוויות אקסוגניות והיא שיטה לא הרסנית עם רזולוציה תת-תאית.
ניתן להשתמש במיקרוסקופיה של Autofluorescence על דגימות חיות ועל לימודי קורס זמן. הדמיה אוטופלואורסצנטית יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על כל תאים חיים או רקמה. הדמיה אוטופלואורסצנטית שימשה על נוירון, תא סרטן, גידול, in-vivo, תאי גזע, ותאי מערכת החיסון.
מי שידגים את ההליך יהיה לינגהאו הו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה להדמיה אופטית כמותית באוניברסיטת טקסס A&M. התחל את הניסוי על ידי הפעלת כל הרכיבים של מיקרוסקופ החיים פלואורסצנטיות פלואורסצנטיות רב פוטוניות, כולל מקור הלייזר והגלאים. לפני מיקום הדגימה, הפעילו את מנורת השדה הבהירה וודאו שהאור נכנס לעפעף.
לאחר מכן, בחר מטרה עבור הדמיית התא. אם לא משתמשים במטרת אוויר, יש למרוח טיפה אחת של מדיום הטבילה המתאים על גבי המטרה. מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה על מחזיק הדגימה על במת המיקרוסקופ.
לאחר מכן, מרכז את הדגימה עם המטרה באמצעות בקרת שלב X/ Y ודא כי הדגימה מאובטחת ולא תזוז במהלך הדמיה. לאחר ביצוע, להסתכל לתוך העין ולהזיז את המטרה למעלה כדי להתמקד בתאים. אם המיקרוסקופ נמצא בתוך מתחם, סגור את דלת תיבת האור.
לאחר מכן, פתח את תוכנת רכישת התמונה ולחץ על הכרטיסיה הדמיה מרובת פוטונים כדי להגדיר את הפרמטרים הדמיה מרובת פוטונים כמתואר בכתב היד. התאם את הרווח של הגלאי לערך האופטימלי עבור הדמיית חיי הפלואורסצנטיות, או FILM. לאחר מכן, שנה את זמן ההשתהות של הוצאות הלייזר בכל פיקסל של הדגימה לערך הרצוי.
עבור ניקוטינאמיד אדנין אדנין פוספט דינוקלאוטיד, או NADPH, הגדר את הלייזר רב-פוטונים ל-750 ננומטר. לאחר מכן, ודא כי בקרת הכוח עבור הלייזר מוגדרת באפס, כך התאים אינם פגומים בעת פתיחת התריס על הלייזר. הגדר מסנן פליטה ב 400 עד 500 ננומטר.
כאשר הפרמטרים מוגדרים, התחל הדמיה באופן מיקוד או הצגה חיה כדי למטב את הגדרות התמונה. הגדל לאט את כוח הלייזר משלושה לשמונה מילי-וואט תוך הקפדה שהתאים נמצאים בפוקוס. לאחר ההתאמה, רשום את העוצמה המרבית שבה נעשה שימוש.
השתמש בהגדרת הכוח המרבית המוקלטת להדמיה בקטעים אחרים של צלחת פטרי. אסוף תמונת NADPH-FILM עם זמן שילוב תמונה של 60 שניות ובדוק שלתמונה יש מספר מספיק של פוטונים, כגון שיא של 100 פוטונים לפיקסל ציטופלסמה בתוך עקומת הריקבון של חיי הפלואורסצנטיות. אם מספר הפוטונים נמוך מדי, הגדל את עוצמת הלייזר או את משך הזמן של רכישת התמונה.
עבור אדנין dinucleotide flavin, או FAD, הדמיה, להגדיר את לייזר רב פוטון ל 890 ננומטר ולחכות לייזר למצב נעילה באורך הגל החדש. ודא כי בקרת הכוח עבור הלייזר מוגדרת באפס בתחילה. הגדר מסנן פליטה ב 500 עד 600 ננומטר.
כדי למטב את הגדרות התמונה, התחל בהדמיה באופן ממוקד או צפייה חיה על-ידי הגדלת עוצמת הלייזר ל-5 עד 10 מילי-וואט ורישום העוצמה המרבית שבה נעשה שימוש. השתמש באותה הגדרת צריכת חשמל עבור הדמיית ה- FAD של שדות התצוגה הבאים. אסוף את תמונת FAD-FILM עם זמן שילוב תמונה של 60 שניות ובדוק שלתמונה יש מספיק פוטונים בתוך עקומת הריקבון של חיי הפלואורסצנטיות.
אם מספר הפוטונים נמוך מדי, הגדל את עוצמת הלייזר או משך הזמן של רכישת התמונה וחזור על ההדמיה עבור ארבעה עד חמישה שדות ראייה נוספים, או FOVs, כאשר כל תמונה מרווחת במרחק של שני FOVs. כדי ליצור פתרון ציאניד נתרן 80 מילימולרי, להמיס 130.24 מיליגרם של ציאניד נתרן ב 25 מיליליטר של PBS. מתוך צלחת התרבות, לשאוף 100 microliters של מדיום תרבות להחליף עם 100 מיקרוליטרים של פתרון ציאניד נתרן כדי לקבל ריכוז ארבעה מילימולרי של ציאניד בצלחת.
שים את התאים באינקובטור במשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים להגיב עם פתרון ציאניד. לאחר החשיפה ציאניד, לרכוש NADPH ו FAD תמונות של התאים כפי שתואר קודם לכן. המחקר חישב את הפרמטרים של אורך החיים של הפלואורסצנטיות באמצעות פונקציית התגובה הנמדדת של המכשיר, או IRF, מאוריאה.
הפרמטרים היו בממוצע על פני הפיקסלים של הציטופלסמה של כל תא המשמש לפילוח. תאים בודדים זוהו והוסוו מסכות כדי למנוע רעשי רקע. לאחר מכן, הגרעין זוהה והוקרן על מסכת התא.
כמו כן, התאים סוננו כדי להסיר את האזורים עם המסיכה שאינם מתאימים לגודל של תאים טיפוסיים. הדמיית חיי הפלואורסצנטיות הרב-פוטונית של NADPH ו- FAD אפשרה הדמיה של מורפולוגיה של תאים וחילוף חומרים לפני ואחרי טיפול ציאניד. זה נצפתה כי חיים NADPH פוחתת עם טיפול ציאניד, בעוד החיים FAD עולה לאחר טיפול ציאניד.
תרשים התיבה הייצוגית הצביע על כך שיחס ה- redox האופטי של תאי MCF7 ירד לאחר טיפול ציאניד. החשיפה ציאניד הפחיתה את אורך החיים NADPH משוקלל משרעת של תאי MCF7. אורך החיים הקצר והארוך ירד עבור NADPH, אבל גדל עבור NADPH אלפא אחד.
עבור FAD, אורך החיים משוקלל משרעת של תאי MCF7 גדל לאחר חשיפה ציאניד. הן אורך החיים הקצר והארוך גדל עבור FAD, אך ירד עבור FAD אלפא אחד. חשוב שיהיה מספיק כוח לייזר הולך לדגימות, אבל לזכור, יותר מדי כוח יכול לגרום נזק לתאים.
מכיוון שהדמיה אוטופלואורסצנטית אינה מזיקה לתאים, ניתן להשתמש בבדיקות ביוכימיות עוקבות באותן דגימות.
