从mRNA中去除内部翻译起始位点，同时保留全长蛋白的表达

单个残基取代的困难在于，尽管单个残基存在差异，但要有效地对动物进行基因分型。限制性内切酶的特殊使用仅为典型的基于PCR的基因分型增加了单一、快速和低成本的步骤。如果目标序列被限制性内切酶识别，则该协议可以应用于任何其他具有突变点的小鼠模型，通常情况就是这样。

用干净的剪刀切一到三毫米的尾尖，并将其转移到0.2毫升八条PCR管中。按照手稿中的描述包含尾部样品后，将其储存在T-minus 20摄氏度直至提取，最多约一周。每管加入100微升组织裂解液并充分混合，然后使用台式小型离心机在室温下以2， 200倍G旋转10秒。

确保尾部样品浸没在溶液中。通过对组织裂解、灭活和保温的参数进行编程，将试管设置到热循环仪上。如果不能立即进行PCR，请将组织裂解物在四摄氏度下储存长达一周。

制备PCR溶液，其中含有5微升无核酸酶水，0.75微升10微摩尔正向和反向引物，以及每个样品7.5微升PCR预混液到新的PCR管中。将一微升先前制备的组织裂解物加入PCR溶液中。充分混合PCR溶液，并在室温下用台式微型离心机以2， 200倍G离心10秒。

将试管安装到编程的热循环仪上。反应完成后，将PCR产物在4摄氏度下储存一至两个月或在零下20摄氏度下储存约一年。制备含有七微升无核酸酶水，两微升10倍强度的CutSmart缓冲液和一微升NlaIII限制性内切酶的酶溶液。

如果有几个样品，将每种含量相乘以制成混合物，每管等分10微升。每管向酶溶液中加入10微升先前获得的PCR产物。充分混合并使用台式小型离心机旋转，如前所述。

将管子设置在编程的热循环仪或加热块上。在寒冷条件下孵育后储存产品。在50毫升单强度TAE缓冲液中加入0.75克琼脂糖。

在微波炉中混合并加热琼脂糖，直到其完全溶解。冷却后，加入五微升DNA染色剂，轻轻混合。将25毫升琼脂糖凝胶倒入凝胶模具中，使凝胶固化。

将10微升消化的PCR产物加载到孔中。用100伏特电泳凝胶35分钟。在紫外光下对琼脂糖凝胶进行成像。

使用消化的PCR产物进行的琼脂糖电泳在每个基因型中产生了几个不同大小的条带，其中两条条带分别为野生型，三条为杂合子条带，一条为纯合条带。使用囊胚分析进行测试注射后，每微升供体寡核苷酸注射50纳克的成功率为76.9%，同一供体寡核苷酸每微升注射25纳克的成功率为25%。最后，每微升供体寡核苷酸注入50纳克乙醇沉淀，得到成功率为50%的创始动物。

通过乙醇沉淀纯化寡核苷酸供体降低了毒性，同时保持了较高的基因组编辑效率。小心处理和添加少量试剂非常重要。确保正确添加并混合良好。