הקושי בהחלפת שאריות בודדות הוא לגנוטיזציה יעילה של בעלי חיים למרות ההבדל בשאריות בודדות. שימוש מיוחד באנזים הגבלה מוסיף רק שלב אחד, מהיר ובעלות נמוכה לגנוטיפינג טיפוסי המבוסס על PCR. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל מודל עכבר אחר עם נקודת מוטציה אם רצף היעד מזוהה על ידי אנזים הגבלה, וזה בדרך כלל המקרה.
חותכים 1 עד 3 מילימטרים של קצה הזנב עם מספריים נקיים ולהעביר אותו לצינור PCR שמונה רצועות 0.2 מיליליטר. לאחר שהכיל את דגימת הזנב כמתואר בכתב היד, לאחסן אותו ב T-מינוס 20 מעלות צלזיוס עד החילוץ, עד כשבוע. הוסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת תמיסת רקמות לכל צינור וערבוב היטב, ואחריו ספין למטה באמצעות minicentrifuge שולחן ב 2, 200 פעמים G במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר.
ודא שדגימות הזנב שקועות בפתרון. הגדר את הצינורות על מחזור תרמי להגדיר על ידי תכנות הפרמטרים עבור תמוגה רקמות, השבתה, והחזקה. לאחסן את lysate הרקמה בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע אם PCR לא ניתן לבצע באופן מיידי.
הכינו פתרון PCR המכיל חמישה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז, 0.75 מיקרוליטרים של פריימרים קדמיים והפוך של 10 מיקרומולרים, ו-7.5 מיקרוליטרים של תערובת ראשית PCR לדגימה לצינור PCR חדש. הוסף מיקרוליטר אחד של ליסאט הרקמה שהוכן בעבר לתמיסת ה- PCR. ערבבו היטב את תמיסת ה-PCR והסתובבו עם מיני-צנטריפוגה עם שולחן ב-2, 200 פעמים G למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר.
הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי מתוכנת. לאחר השלמת התגובה, לאחסן את מוצרי PCR בארבע מעלות צלזיוס במשך חודש עד חודשיים או כשנה אחת במינוס 20 מעלות צלזיוס. הכינו את תמיסת האנזים המכילה שבעה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז, שני מיקרוליטרים של מאגר CutSmart בעוצמה של פי 10, ומיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת NlaIII.
אם יש כמה דוגמאות, להכפיל כל תוכן כדי להפוך את התערובת aliquot 10 microliters לכל צינור. הוסף 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR שהושג בעבר לתמיסת האנזים לכל צינור. מערבבים היטב ומסתובבים עם המיני-צנטריפוגה של השולחן כפי שהוכח בעבר.
הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי מתוכנת או בלוק חום. יש לאחסן את המוצר לאחר הדגירה בתנאי קור. הוסף 0.75 גרם של agarose ב 50 מיליליטר של חיץ TAE חד-כוח.
מערבבים ומחממים את האגרוז במיקרוגל עד שהוא מתמוסס לחלוטין. לאחר קירורו, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של כתם DNA וערבבו בעדינות. יוצקים 25 מיליליטר של ג'ל agarose לתוך תבנית הג'ל ולאפשר את הג'ל להתמצק.
טען 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR מעוכל לבאר. הפעל את הג'ל עם 100 וולט במשך 35 דקות. דמיינו את ג'ל האגרוז תחת אור אולטרה סגול.
האלקטרופורזה האגרוזית שבוצעה באמצעות מוצר ה- PCR המעוכל הביאה למספר להקות בגדלים שונים בכל גנוטיפ, עם שתי להקות בסוג פראי, שלוש בהטרוזיגוס ואחת בהומוזיגוס, בהתאמה. הזרקת בדיקה עם ניתוח בלסטוציסט הביאה לשיעור הצלחה של 76.9% בהזרקת 50 ננוגרם למיקרוליטר של אוליגוס התורם, ושיעור הצלחה של 25% בהזרקת 25 ננוגרם למיקרוליטר של אותו אוליגוס תורם, בהתאמה. לבסוף, הזרקת 50 ננוגרם לכל מיקרוליטר של אוליגוס התורם עם משקעים אתנול השיג בעלי חיים מייסדים עם 50% הצלחה.
טיהור תורמי אוליגו על ידי משקעים אתנול הוריד את הרעילות תוך שמירה על יעילות עריכת גנום גבוהה. טיפול זהיר והוספת כמות נמוכה של ריאגנטים חשוב מאוד. ודא שהם מתווספים כראוי ומעורבים היטב.
