Трудность с заменой одного остатка заключается в эффективном генотипировании животных, несмотря на разницу в единичном остатке. Специальное использование фермента рестрикции добавляет только один, быстрый и недорогой шаг к типичному генотипированию на основе ПЦР. Этот протокол может быть применен к любой другой мышиной модели с точкой мутации, если целевая последовательность распознается ферментом рестрикции, что обычно и происходит.
Отрежьте один-три миллиметра кончика хвоста чистыми ножницами и переложите его в 0,2-миллилитровую восьмиполосную ПЦР-трубку. После хранения образца хвоста, как описано в рукописи, храните его при Т-минус 20 градусах Цельсия до извлечения, примерно до недели. Добавьте 100 микролитров раствора лизиса тканей на пробирку и хорошо перемешайте, а затем открутите вниз с помощью настольной миницентрифуги при 2, 200 раз G в течение 10 секунд при комнатной температуре.
Убедитесь, что образцы хвоста погружены в раствор. Установите трубки на термоциклер, запрограммировав параметры лизиса, инактивации и удержания тканей. Храните тканевый лизат при четырех градусах Цельсия в течение недели, если ПЦР не может быть выполнена немедленно.
Готовят раствор ПЦР, содержащий пять микролитров воды без нуклеазы, 0,75 микролитра 10-микромолярной прямой и обратной праймеров и 7,5 микролитра мастер-смеси ПЦР на образец в новую ПЦР-трубку. Добавьте один микролитр предварительно приготовленного тканевого лизата в раствор ПЦР. Хорошо перемешайте раствор ПЦР и открутите его с помощью настольной миницентрифуги при 2, 200 раз g в течение 10 секунд при комнатной температуре.
Установите трубки на программируемый тепловой цикл. Как только реакция будет завершена, храните продукты ПЦР при четырех градусах Цельсия в течение одного-двух месяцев или примерно одного года при минус 20 градусах Цельсия. Приготовьте раствор фермента, содержащий семь микролитров воды без нуклеазы, два микролитра буфера CutSmart с силой 10X и один микролитр фермента рестрикции NlaIII.
Если образцов несколько, умножьте каждое содержимое, чтобы получилась смесь, и аликвотьте 10 микролитров на пробирку. Добавьте 10 микролитров ранее полученного продукта ПЦР к раствору фермента на пробирку. Хорошо перемешайте и раскрутите с помощью настольной мини-центрифуги, как показано ранее.
Установите трубки на программируемый тепловой циклер или тепловой блок. Хранить продукт после инкубации в холодных условиях. Добавьте 0,75 г агарозы в 50 миллилитра однопрочного буфера TAE.
Смешайте и нагрейте агарозу в микроволновой печи, пока она полностью не растворится. После охлаждения добавьте пять микролитров пятна ДНК и аккуратно перемешайте. Налейте 25 миллилитров агарозного геля в гелевую форму и дайте гелю затвердеть.
Загрузите в скважину 10 микролитров переваренного продукта ПЦР. Запустите гель со 100 вольт в течение 35 минут. Изобразите агарозный гель под ультрафиолетовым светом.
Электрофорез агарозы, выполненный с использованием переваренного продукта ПЦР, привел к образованию нескольких полос разных размеров в каждом генотипе, с двумя полосами в диком типе, тремя в гетерозиготных и одной в гомозиготных, соответственно. Тестовая инъекция с анализом бластоцисты привела к 76,9% успеха при введении 50 нанограммов на микролитр донорского олиго и 25% успеха при введении 25 нанограммов на микролитр того же донорского олигоса, соответственно. Наконец, инъекция 50 нанограммов на микролитр донорских олиго с осаждением этанола получила животных-основателей с 50%-ным успехом.
Очистка доноров олиго осаждением этанола снижала токсичность при сохранении высокой эффективности редактирования генома. Тщательное обращение и при добавлении небольшого количества реагентов очень важно. Убедитесь, что они правильно добавлены и хорошо перемешаны.
