Die Schwierigkeit bei der Substitution einzelner Rückstände besteht darin, Tiere trotz des Unterschieds in den einzelnen Rückständen effizient zu genotypisieren. Die spezielle Verwendung eines Restriktionsenzyms fügt der typischen PCR-basierten Genotypisierung nur einen einzigen, schnellen und kostengünstigen Schritt hinzu. Dieses Protokoll kann auf jedes andere Mausmodell mit einem Mutationspunkt angewendet werden, wenn die Zielsequenz von einem Restriktionsenzym erkannt wird, was normalerweise der Fall ist.
Schneiden Sie mit einer sauberen Schere ein bis drei Millimeter der Heckspitze ab und geben Sie sie in eine 0,2-Milliliter-Acht-Streifen-PCR-Röhre. Nachdem Sie die im Manuskript beschriebene Schwanzprobe enthalten haben, lagern Sie sie bis zur Extraktion bis zu etwa einer Woche bei T-minus 20 Grad Celsius. Fügen Sie 100 Mikroliter Gewebelyselösung pro Röhrchen hinzu und mischen Sie gut, gefolgt von einem Spin-Down mit einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.200 mal G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur.
Stellen Sie sicher, dass die Schwanzproben in die Lösung eingetaucht sind. Stellen Sie die Röhrchen auf einen Thermocycler-Satz ein, indem Sie die Parameter für die Gewebelyse, Inaktivierung und das Halten programmieren. Lagern Sie das Gewebelysat bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche, wenn die PCR nicht sofort durchgeführt werden kann.
Bereiten Sie eine PCR-Lösung vor, die fünf Mikroliter nukleasefreies Wasser, 0,75 Mikroliter 10-Mikromolare Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 7,5 Mikroliter PCR-Master-Mix pro Probe zu einem neuen PCR-Röhrchen enthält. Geben Sie einen Mikroliter des zuvor hergestellten Gewebelysats in die PCR-Lösung. Mischen Sie die PCR-Lösung gut und drehen Sie sie mit einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.200 mal G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur herunter.
Stellen Sie die Rohre auf einen programmierten Thermocycler. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, lagern Sie die PCR-Produkte bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Monate oder etwa ein Jahr bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie die Enzymlösung vor, die sieben Mikroliter nukleasefreies Wasser, zwei Mikroliter CutSmart-Puffer mit 10-facher Stärke und einen Mikroliter NlaIII-Restriktionsenzym enthält.
Wenn es mehrere Proben gibt, multiplizieren Sie jeden Inhalt zu der Mischung und aliquot 10 Mikroliter pro Röhrchen. Fügen Sie 10 Mikroliter PCR-Produkt, das zuvor erhalten wurde, der Enzymlösung pro Röhrchen hinzu. Gut mischen und mit der Tisch-Minizentrifuge nach unten drehen, wie zuvor gezeigt.
Stellen Sie die Rohre auf einen programmierten Thermocycler oder Wärmeblock ein. Lagern Sie das Produkt nach der Inkubation unter kalten Bedingungen. Fügen Sie 0,75 Gramm Agarose in 50 Milliliter eindichten TAE-Puffer hinzu.
Rühren und erhitzen Sie die Agarose in der Mikrowelle, bis sie sich vollständig auflöst. Nach dem Abkühlen fünf Mikroliter DNA-Flecken hinzufügen und vorsichtig mischen. Gießen Sie 25 Milliliter des Agarosegels in die Gelform und lassen Sie das Gel erstarren.
Laden Sie 10 Mikroliter verdautes PCR-Produkt in die Vertiefung. Lassen Sie das Gel mit 100 Volt für 35 Minuten laufen. Stellen Sie sich das Agarosegel unter ultraviolettem Licht vor.
Die Agaroseelektrophorese, die mit dem verdauten PCR-Produkt durchgeführt wurde, führte zu mehreren Banden unterschiedlicher Größe in jedem Genotyp, mit zwei Banden im Wildtyp, drei in Heterozygoten und einer bei Homozygoten. Die Testinjektion mit Blastozystenanalyse führte zu einer Erfolgsquote von 76,9% bei der Injektion von 50 Nanogramm pro Mikroliter der Spenderoligos und einer Erfolgsrate von 25% bei der Injektion von 25 Nanogramm pro Mikroliter derselben Spenderoligos. Schließlich wurden durch die Injektion von 50 Nanogramm pro Mikroliter der Spenderoligos mit Ethanolfällung Grundtiere mit einer Erfolgsquote von 50% erzielt.
Die Reinigung von Oligospendern durch Ethanolfällung senkte die Toxizität und behielt gleichzeitig eine hohe Effizienz bei der Genombearbeitung bei. Eine sorgfältige Handhabung und die Zugabe einer geringen Menge an Reagenzien ist sehr wichtig. Stellen Sie sicher, dass sie korrekt hinzugefügt und gut gemischt werden.
