単一残基置換の難しさは、単一残基の違いにもかかわらず動物を効率的にジェノタイピングすることである。制限酵素を特別に使用すると、典型的なPCRベースのジェノタイピングに1つの迅速で低コストのステップしか追加されません。このプロトコルは、標的配列が制限酵素によって認識される場合、変異点を有する他の任意のマウスモデルに適用することができる(これは通常そうである)。
尾の先端をきれいなハサミで1~3ミリカットし、0.2ミリリットルの8ストリップPCRチューブに移します。原稿に記載されているように尾部サンプルを入れた後、抽出までTマイナス20°Cで、約1週間まで保管してください。チューブあたり100マイクロリットルの組織溶解溶液を加え、よく混合し、続いて卓上小型遠心分離機を用いて2,200倍Gで室温で10秒間スピンダウンした。
テールサンプルが溶液に沈んでいることを確認します。組織溶解、不活性化、および保持のパラメータをプログラミングすることによって、チューブをサーマルサイクラーにセットします。PCRをすぐに実行できない場合は、組織溶解液を摂氏4度で最大1週間保存してください。
サンプルあたり 5 マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、0.75 マイクロリットルの 10 マイクロモルのフォワードプライマーとリバースプライマー、および 7.5 マイクロリットルの PCR マスターミックスを含む PCR 溶液を新しい PCR チューブに準備します。予め調製した組織溶解液1マイクロリットルをPCR溶液に加える。PCR溶液をよく混合し、卓上型ミニ遠心分離機で2,200倍のGで室温で10秒間スピンダウンします。
チューブをプログラムされたサーマルサイクラーにセットします。反応が完了したら、PCR産物を摂氏4度で1~2ヶ月間、またはマイナス20度で約1年間保管してください。ヌクレアーゼを含まない水 7 マイクロリットル、10 倍の強度で 2 マイクロリットルの CutSmart バッファー、および 1 マイクロリットルの NlaIII 制限酵素を含む酵素溶液を調製します。
複数のサンプルがある場合は、各含有量を掛けて混合物を作り、チューブあたり10マイクロリットルをアリコートします。以前に得られた10マイクロリットルのPCR産物を酵素溶液に1本のチューブあたりに加える。よく混ぜて、前に示したように卓上ミニ遠心分離機でスピンダウンします。
チューブをプログラムされたサーマルサイクラーまたはヒートブロックにセットします。低温条件下でのインキュベーション後に製品を保管する。50ミリリットルの単一強度TAEバッファーに0.75グラムのアガロースを加える。
アガロースが完全に溶解するまで電子レンジでアガロースを混ぜて加熱する。それを冷却した後、5マイクロリットルのDNA染色剤を加え、穏やかに混ぜる。25ミリリットルのアガロースゲルをゲルモールドに注ぎ、ゲルを固化させる。
10マイクロリットルの消化PCR産物をウェルにロードする。ゲルを100ボルトで35分間実行します。紫外線下でアガロースゲルを画像化します。
消化されたPCR産物を用いて行われたアガロース電気泳動は、各遺伝子型において異なるサイズのいくつかのバンドをもたらし、それぞれ野生型に2つのバンド、ヘテロ接合型で3つ、およびホモ接合型で1つのバンドをもたらした。胚盤胞分析による試験注入は、ドナーオリゴのマイクロリットル当たり50ナノグラムを注入することにおいて76.9%の成功率をもたらし、同じドナーオリゴのマイクロリットル当たり25ナノグラムを注入することにおいてそれぞれ25%の成功率をもたらした。最後に、エタノール沈殿を用いてドナーオリゴのマイクロリットル当たり50ナノグラムを注入し、50%の成功率で創始者動物を得た。
エタノール沈殿によるオリゴドナーの精製は、高いゲノム編集効率を維持しながら毒性を低下させた。慎重な取り扱いと少量の試薬を添加する上では非常に重要です。それらが正しく追加され、よく混合されていることを確認してください。
