تكمن الصعوبة في استبدال بقايا واحدة في التنميط الجيني للحيوانات بكفاءة على الرغم من الاختلاف في البقايا المفردة. يضيف الاستخدام الخاص لإنزيم التقييد خطوة واحدة وسريعة ومنخفضة التكلفة فقط إلى التنميط الجيني النموذجي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي نموذج ماوس آخر مع نقطة طفرة إذا تم التعرف على التسلسل المستهدف بواسطة إنزيم تقييد ، وهو ما يحدث عادة.
قطع واحد إلى ثلاثة ملليمترات من طرف الذيل مع مقص نظيف ونقله إلى أنبوب PCR 0.2 ملليلتر ثمانية شرائط. بعد احتواء عينة الذيل كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتخزينها عند T-ناقص 20 درجة مئوية حتى الاستخراج ، حتى حوالي أسبوع. أضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل الأنسجة لكل أنبوب واخلطها جيدا ، متبوعا بالدوران لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة عند 2،200 مرة من G لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة.
تأكد من غمر عينات الذيل في المحلول. اضبط الأنابيب على جهاز تدوير حراري يتم تعيينه عن طريق برمجة معلمات تحلل الأنسجة وتعطيلها والاحتفاظ بها. قم بتخزين الأنسجة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع إذا تعذر إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الفور.
قم بإعداد محلول PCR يحتوي على خمسة ميكرولترات من الماء الخالي من النوكليز ، و 0.75 ميكرولتر من 10 ميكرومولات إلى الأمام والخلف. أضف ميكرولتر واحد من محللات الأنسجة المعدة مسبقا إلى محلول PCR. امزج محلول تفاعل البوليميراز المتسلسل جيدا وقم بالدوران لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة بسرعة 2 ، 200 مرة G لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة.
اضبط الأنابيب على جهاز تدوير حراري مبرمج. بمجرد اكتمال التفاعل ، قم بتخزين منتجات PCR عند أربع درجات مئوية لمدة شهر إلى شهرين أو ما يقرب من عام واحد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. تحضير محلول الإنزيم الذي يحتوي على سبعة ميكرولترات من الماء الخالي من النوكليز ، وميكرولترين من المخزن المؤقت CutSmart بقوة 10X ، وميكرولتر واحد من إنزيم تقييد NlaIII.
إذا كان هناك عدة عينات ، فاضرب كل محتوى لصنع الخليط و aliquot 10 ميكرولتر لكل أنبوب. أضف 10 ميكرولترات من منتج PCR الذي تم الحصول عليه مسبقا إلى محلول الإنزيم لكل أنبوب. اخلطي جيدا ودلكي لأسفل مع جهاز الطرد المركزي الصغير على الطاولة كما هو موضح سابقا.
اضبط الأنابيب على جهاز تدوير حراري مبرمج أو كتلة حرارية. تخزين المنتج بعد الحضانة في ظل ظروف باردة. أضف 0.75 جرام من الأغاروز في 50 ملليلتر من المخزن المؤقت TAE أحادي القوة.
اخلطي الأغاروز وسخنيه في الميكروويف حتى يذوب تماما. بعد تبريده ، أضف خمسة ميكرولترات من بقعة الحمض النووي واخلطها بلطف. صب 25 ملليلتر من هلام الأغاروز في قالب الجل واسمح للهلام بالتصلب.
قم بتحميل 10 ميكرولترات من منتج PCR المهضوم إلى البئر. قم بتشغيل الجل بجهد 100 فولت لمدة 35 دقيقة. صورة هلام الأغاروز تحت الأشعة فوق البنفسجية.
أدى الرحلان الكهربائي الأغاروز الذي تم إجراؤه باستخدام منتج PCR المهضوم إلى عدة نطاقات بأحجام مختلفة في كل نمط وراثي ، مع نطاقين في النوع البري ، وثلاثة في متغايرة الزيجوت ، وواحد في متماثل الزيجوت ، على التوالي. أدى اختبار الحقن مع تحليل الكيسة الأريمية إلى معدل نجاح 76.9٪ في حقن 50 نانوغرام لكل ميكرولتر من الأوليغوس المانحة ، ومعدل نجاح 25٪ في حقن 25 نانوغرام لكل ميكرولتر من نفس أوليجو المانحة ، على التوالي. وأخيرا ، فإن حقن 50 نانوغرام لكل ميكرولتر من الأوليغوس المانحة مع هطول الأمطار الإيثانول حصل على الحيوانات المؤسسة بمعدل نجاح 50 ٪.
أدى تنقية المتبرعين بالأوليغو عن طريق هطول الأمطار بالإيثانول إلى خفض السمية مع الحفاظ على كفاءة تحرير الجينوم العالية. التعامل الدقيق وإضافة كمية منخفضة من الكواشف مهم جدا. تأكد من إضافتها بشكل صحيح وخلطها جيدا.
