用于研究髓磷脂中央微管蛋白依赖性缺陷的无标记非线性光学器件

生物样品的二次谐波生成成像是一种光学技术，无需标签或染料即可可视化非中心对称分子及其组装。用这种方法生成的图像背景较低，因为很少有生物分子可以作为协调力。该协议描述了在taiep动物模型中微管蛋白β-4A诊断成像技术的应用。

微管蛋白病是最近描述的疾病。出于这个原因，关于细胞水平病理生理学的基本机制的信息有限。首先，打开脉冲激光器以确保它准备好以最佳和稳定的功率水平供电。

为了研究鼬岛微管，使用10%至20%的可用激光功率，在所述系统中对应于在物镜后焦平面处测量的13至26毫瓦。在成像之前，将激光旋转到810纳米。然后确保显微镜与用于二次谐波产生或SHG成像的物镜对准。

从光学检测路径上取下不需要的滤光片，并确保聚光镜隔膜完全打开，并且没有不必要的光线停止。准备一个25x x 0.8数值孔径的油浸物镜，在镜头中加入一小滴浸油。按照表中报告的步骤进行操作，除了玉米淀粉的激光功率小于5%。

图像夹在载玻片之间的干玉米淀粉。使用SHG参数生成SHG图像，它们揭示了激光偏振方向。捕获稀疏玉米淀粉颗粒的一张图像，并在XY平面上标记与激光偏振方向相对应的SHG小叶的方向。

为了控制，拍摄同一样品的另一张图像，将半波板插入光路以改变激光的振荡方向。生成的图像显示旋转的SHG信号小叶。如果对SHG使用不同的带通滤光片，请通过沿扫描线逐像素比较图像和信号强度来确保其具有最佳的传输特性。

准备一个装满温热汉克斯平衡盐溶液或HBSS的振动切片机缓冲托盘。使用氰基丙烯酸酯胶通过一块遮蔽胶将大脑固定在标本板上。最尾部与胶水接触，以便可以切割来自对面喙部的可用冠状部分。

将试样板转移到缓冲托盘内的磁性支架上。开始切割300到500微米的部分，直到切片覆盖整个大脑表面。然后将切片的厚度减小到 160 微米。

一旦在胼胝体水平处切割 160 微米的切片，请使用带有大法兰孔的改良玻璃巴斯德移液管将其恢复。将切片转移到带有新温HBSS的干净培养皿中，或直接转移到盖玻片或玻璃底培养皿上进行显微镜检查。将样品放在显微镜下，并通过透射光的目镜直接观察将其适当地放置在物镜下方。

去除多余的HBSS，使薄的液膜覆盖整个样品。每隔几分钟目视检查一次液膜，以避免样品过度蒸发和干燥。准备显微镜载物台进行非去扫描成像，包括关闭深色培养室的所有门或用黑色尼龙聚氨酯涂层织物覆盖培养室。

沿传输路径选择非去扫描成像模式。这样，微管蛋白微弱SH信号的捕获将得到优化。然后选择目标。

接下来，设置像素停留时间为 12.6 微秒的激光功率。以5倍的速度拍摄不大于512×512像素的图像，平均速度为2，平均采集时间为15秒。首先使用485纳米短波通滤光片捕获图像，在第二步中，添加清晰的405纳米带通滤光片。

用手术刀将小脑切成两个半球，并通过中间部分将它们固定在振动切片机支架上。使用与大脑描述的相同的振动切片机、刀片和显微镜设置对小脑进行切片和成像。当胼胝体的纤维成像时，在太极脑中观察到纤维状的短结构和圆形元素。

相比之下，对照大脑的胼胝体在整个大脑区域显示出更加异质性和各向同性的信号。差分信号的起源具体在于二次谐波产生现象，因为添加窄带通滤波器只会降低控制图像中的非特定信号强度，同时选择性地从taiep图像中总是产生强烈SH光的体细胞样和短细长结构周围去除这种低漫射信号。在小脑白质对照组织中，观察到完全没有SH信号。

使用短通滤光片时，浦肯野细胞几乎不可见，细长和圆形的结构在太平组织的SH图像中持续存在。获得最佳图像的关键步骤是尽可能薄地切割组织切片。此外，处理急性组织切片需要快速方案以防止组织变质。

因此，事先设置和检查光学系统至关重要。来自微管的二次谐波信号比来自淀粉的二次谐波信号弱。因此，必须使用更多的激光功率来成像微管。

应小心增加激光功率，因为由于使用高数值孔径物镜进行成像，样品处的强度会迅速增加 通过二次谐波产生成像，可以快速轻松地识别微管病变模型中央髓鞘的病理变化。该技术的潜在应用包括用于研究H-ABC微管蛋白病的基本机制和评估药物治疗患者。从长远来看，该技术有可能成为一种补充诊断工具，可用于颅内或新鲜活检。