La imagen de segunda generación armónica de muestras biológicas es una técnica óptica que permite la visualización de moléculas no centrosimétricas y sus ensamblajes sin necesidad de una etiqueta o un tinte. Las imágenes generadas con este método tienen bajo fondo ya que muy pocas moléculas biológicas podrían actuar como una fuerza harmona. Este protocolo describe la aplicación de la técnica para el diagnóstico por imágenes de Tubulina beta-4A en el modelo animal taiep.
Las tubulinopatías son enfermedades descritas recientemente. Por esta razón, se dispone de una cantidad limitada de información sobre los mecanismos básicos que subyacen a la fisiopatología a nivel celular. Para comenzar, encienda el láser de pulso para asegurarse de que estará listo para lase a un nivel de potencia óptimo y constante.
Para estudiar los microtúbulos tisulares se utiliza del 10 al 20% de la potencia láser disponible, que en el sistema descrito corresponde a 13 a 26 milivatios medidos en el plano focal posterior del objetivo. Antes de la obtención de imágenes, gire el láser a 810 nanómetros. Luego, asegúrese de que el microscopio esté alineado con Koehler con el objetivo utilizado para la segunda generación armónica, o imágenes SHG.
Retire los filtros no deseados de la ruta de detección óptica y asegúrese de que el diafragma del condensador esté completamente abierto y que no se detenga la luz innecesariamente. Prepare un objetivo de inmersión en aceite de apertura numérica de 25x por 0.8 con una pequeña gota de aceite de inmersión en la lente. Siguiendo los pasos indicados en la tabla aquí, excepto para la potencia del láser que es inferior al 5% para el almidón de maíz.
Imagen de almidón de maíz seco intercalado entre diapositivas de vidrio. con parámetros SHG para generar imágenes SHG, revelan la dirección de polarización del láser. Capture una imagen de granos de almidón de maíz dispersos y marque la orientación de los lóbulos SHG en el plano XY correspondiente a la orientación de polarización del láser.
Para el control, tome otra imagen de la misma muestra insertando una placa de media onda en la trayectoria óptica para alterar la dirección de oscilación del láser. La imagen resultante muestra lóbulos de señal SHG girados. Si utiliza un filtro de paso de banda diferente para el SHG, asegúrese de que tenga propiedades de transmisión óptimas comparando las imágenes y las intensidades de la señal píxel por píxel a lo largo de la línea de escaneo.
Prepare una bandeja tampón de vibratomo llena con una solución salina caliente de Hanks'Balanced o HBSS. Fije el cerebro a la placa de la muestra usando pegamento de cianoacrilato a través de un trozo de cinta adhesiva. La porción más caudal entra en contacto con el pegamento para que se puedan cortar las secciones coronales utilizables de la porción rostral opuesta.
Transfiera la placa de la muestra a su soporte magnético dentro de la bandeja intermedia. Comience a cortar secciones de 300 a 500 micras hasta que las rebanadas abarquen toda la superficie del cerebro. Luego reduzca el grosor de la sección a 160 micras.
Una vez cortada una sección de 160 micras a nivel del cuerpo calloso, recuperarla con una pipeta Pasteur de vidrio modificada con un orificio bridado grande. Transfiera la sección a una placa de Petri limpia con HBSS nuevo caliente o directamente sobre el cubrebocas o el plato con fondo de vidrio para microscopía. Coloque la muestra bajo el microscopio y colóquela adecuadamente debajo del objetivo mediante observación directa a través de los oculares con luz transmitida.
Retire el exceso de HBSS para que una película líquida delgada cubra toda la muestra. Revise visualmente la película líquida cada pocos minutos para evitar la evaporación excesiva y el secado de la muestra. Prepare la etapa del microscopio para imágenes no escaneadas, lo que incluye cerrar todas las puertas de la cámara de incubación oscura o cubrir la cámara de incubación con una tela recubierta de poliuretano de nylon negro.
Seleccione el modo de imagen no escaneado a lo largo de la ruta de transmisión. De esta manera, se optimizará la captura de la débil señal SH de tubulina. A continuación, seleccione el objetivo.
A continuación, configure una potencia láser con un tiempo de permanencia de píxeles de 12,6 microsegundos. Tome imágenes de no más de 512 por 512 píxeles con una velocidad de cinco y un promedio de dos para un tiempo de adquisición promedio de 15 segundos. Capture imágenes primero con un filtro de paso corto de 485 nanómetros y, en un segundo paso, agregue un filtro de paso de banda nítido de 405 nanómetros.
Corte el cerebelo con un bisturí en dos hemisferios y fíjelos al soporte del vibratomo por la porción media. Secciona e imagen del cerebelo usando los mismos ajustes de vibratoma, cuchilla y microscopio que se describen para el cerebro. Cuando se obtienen imágenes de las fibras del cuerpo calloso, se observan estructuras cortas similares a fibras y elementos redondeados en el cerebro taiep.
En contraste, el cuerpo calloso del cerebro de control muestra una señal mucho más heterogénea e isotrópica en toda la región del cerebro. El origen de la señal diferencial se encuentra específicamente en el fenómeno de segunda generación armónica, ya que agregar el filtro de paso de banda estrecho solo disminuye la intensidad de la señal no específica de las imágenes de control, mientras que elimina selectivamente esta señal difusa baja alrededor del soma y las estructuras alargadas cortas en las imágenes taiep que siempre generan luz SH intensa. En el tejido de control de la sustancia blanca cerebelosa, se observó la ausencia completa de señal DAI.
Las células de Purkinje son apenas visibles cuando se usa el filtro de paso corto, y las estructuras alargadas y redondeadas persisten en la imagen SH del tejido taiep. Un paso crítico para obtener la mejor imagen es cortar secciones de tejido lo más delgadas posible. Además, trabajar con secciones de tejido agudo requiere protocolos rápidos para prevenir el deterioro del tejido.
Por lo tanto, es crucial configurar y verificar el sistema óptico de antemano. La señal de segundo armónico de los microtúbulos es más débil que la señal de segundo armónico del almidón. Por lo tanto, se debe usar más potencia láser para obtener imágenes de los microtúbulos.
La potencia del láser debe aumentarse con cuidado porque, como se utiliza un objetivo de apertura numérica alta para la obtención de imágenes, la intensidad en la muestra aumentaría rápidamente Con las imágenes de segunda generación armónica, los cambios patológicos en la mielinómica central del modelo tubulinopático se identifican rápida y fácilmente. Las aplicaciones potenciales de esta técnica incluyen su uso para el estudio de los mecanismos básicos de la tubulinopatía H-ABC y para la evaluación de terapias farmacológicas para tratar a los pacientes. A largo plazo, la técnica tiene el potencial de convertirse en una herramienta de diagnóstico complementaria para ser utilizada intracranealmente o en biopsias frescas.
