Визуализация биологических образцов второй гармонической генерации - это оптический метод, который позволяет визуализировать нецентросимметричные молекулы и их сборки без необходимости использования метки или красителя. Изображения, полученные с помощью этого метода, имеют низкий фон, поскольку очень немногие биологические молекулы могут действовать как гармоническая сила. Этот протокол описывает применение метода диагностической визуализации тубулина бета-4А в модели животных taiep.
Тубулинопатии – это недавно описанные заболевания. По этой причине доступно ограниченное количество информации об основных механизмах, лежащих в основе патофизиологии на клеточном уровне. Для начала включите импульсный лазер, чтобы гарантировать, что он будет готов к работе на оптимальном и устойчивом уровне мощности.
Для исследования тиссулярных микротрубочек используется от 10 до 20% доступной мощности лазера, что в описываемой системе соответствует от 13 до 26 милливатт, измеренных на задней фокальной плоскости объектива. Перед визуализацией поверните лазер на 810 нанометров. Затем убедитесь, что микроскоп выровнен с целью, используемой для генерации второй гармоники или визуализации SHG.
Удалите нежелательные фильтры с оптического пути обнаружения и убедитесь, что диафрагма конденсатора полностью открыта и свет не останавливается без необходимости. Подготовьте масляный объектив с числовой диафрагмой 25x на 0,8 с небольшой каплей погружного масла в объектив. Следуя шагам, указанным в таблице здесь, за исключением мощности лазера, которая составляет менее 5% для кукурузного крахмала.
Изображение сухого кукурузного крахмала, зажатого между стеклянными горками. с параметрами SHG для получения изображений SHG они показывают направление поляризации лазера. Сделайте одно изображение разреженных зерен кукурузного крахмала и отметьте ориентацию долек SHG в плоскости XY, соответствующую ориентации лазерной поляризации.
Для контроля возьмите другое изображение того же образца, вставляющего полуволновую пластину в оптический путь, чтобы изменить направление колебаний лазера. На полученном изображении отображаются повернутые доле сигнала SHG. При использовании другого полосового фильтра для SHG убедитесь, что он обладает оптимальными свойствами передачи, сравнивая изображения и интенсивность сигнала попикселям вдоль линии сканирования.
Подготовьте буферный лоток для вибратома, наполненный теплым раствором сбалансированной соли Хэнкса или HBSS. Закрепите мозг на пластине образца с помощью цианоакрилатного клея через кусок маскировочной ленты. Самая каудальная часть контактирует с клеем, так что пригодные для использования корональные участки из противоположной ростральной части могут быть разрезаны.
Перенесите пластину образца на магнитную опору внутри буферного лотка. Начните резать участки от 300 до 500 микрон, пока срезы не охватят всю поверхность мозга. Затем уменьшите толщину секции до 160 мкм.
После того, как 160-микронный срез разрезан на уровне мозолистого тела, восстановите его с помощью модифицированной стеклянной пипетки Пастера с большим фланцевым отверстием. Перенесите секцию в чистую чашку Петри с новым теплым HBSS или непосредственно на крышку или стеклянную нижнюю тарелку для микроскопии. Поместите образец под микроскоп и расположите его соответствующим образом под объективом путем непосредственного наблюдения через глаз с пропускаемым светом.
Удалите избыток HBSS так, чтобы тонкая жидкая пленка покрывала весь образец. Визуально проверяйте жидкую пленку каждые несколько минут, чтобы избежать чрезмерного испарения и высыхания образца. Подготовьте ступень микроскопа для неосканированной визуализации, которая включает в себя закрытие всех дверей темной инкубационной камеры или покрытие инкубационной камеры черной нейлоновой полиуретановой тканью.
Выберите режим неотсканированной визуализации вдоль пути передачи. Таким образом, захват слабого сигнала SH тубулина будет оптимизирован. Затем выберите цель.
Затем установите мощность лазера со временем выдержки пикселя 12,6 микросекунд. Делайте снимки размером не более 512 на 512 пикселей со скоростью пять и в среднем двумя при среднем времени съемки 15 секунд. Сначала делайте снимки с помощью 485-нанометрового фильтра коротких частот, а на втором этапе добавьте четкий 405-нанометровый полосовой фильтр.
Разрежьте мозжечок скальпелем на два полушария и зафиксируйте их на поддержке вибратома средней частью. Разделите и визуализируйте мозжечок, используя те же настройки вибратома, лезвия и микроскопа, которые описаны для мозга. Когда волокна мозолистого тела визуализируются, в мозге тайепа наблюдаются волокнистые короткие структуры и округлые элементы.
Напротив, мозолистое тело контрольного мозга показывает гораздо более гетерогенный и изотропный сигнал по всей области мозга. Происхождение дифференциального сигнала лежит именно в феномене генерации второй гармоники, поскольку добавление узкополосного фильтра только уменьшает неспецифическую интенсивность сигнала от контрольных изображений, при этом выборочно удаляя этот низкодиффузный сигнал вокруг сомоподобных и коротких вытянутых структур в тайеп-изображениях, которые всегда генерируют интенсивный свет SH. В мозжечковой ткани контроля белого вещества наблюдалось полное отсутствие сигнала SH.
Клетки Пуркинье едва заметны при использовании фильтра коротких проходов, а удлиненные и округлые структуры сохраняются на изображении SH из ткани тайепа. Критическим шагом для получения наилучшего изображения является разрезание участков ткани как можно тоньше. Кроме того, работа с острыми участками тканей требует быстрых протоколов для предотвращения ухудшения состояния тканей.
Поэтому крайне важно заранее настроить и проверить оптическую систему. Сигнал второй гармоники от микротрубочек слабее, чем сигнал второй гармоники от крахмала. Поэтому для визуализации микротрубочек необходимо использовать больше мощности лазера.
Мощность лазера должна быть увеличена осторожно, потому что, поскольку для визуализации используется объектив с высокой числовой апертурой, интенсивность в образце будет быстро увеличиваться При визуализации второй гармонической генерации патологические изменения в центральном миелиномате тубулинопатической модели быстро и легко идентифицируются. Потенциальные применения этого метода включают его использование для изучения основных механизмов тубулинопатии H-ABC и для оценки фармакологической терапии для лечения пациентов. В долгосрочной перспективе этот метод может стать дополнительным диагностическим инструментом для использования внутрикратно или на свежих биопсиях.
