הדמיית הדור ההרמוני השני של דגימות ביולוגיות היא טכניקה אופטית המאפשרת הדמיה של מולקולות לא צנטרוסימטריות והרכבות שלהן ללא צורך בתג או צבע. לתמונות הנוצרות בשיטה זו יש רקע נמוך מכיוון שמעט מאוד מולקולות ביולוגיות יכולות לפעול ככוח הרמוני. פרוטוקול זה מתאר את היישום של הטכניקה להדמיה אבחנתית של טובולין בטא-4A במודל החיות taiep.
טובולינופתיות הן מחלות שתוארו לאחרונה. מסיבה זו, כמות מוגבלת של מידע זמינה על המנגנונים הבסיסיים העומדים בבסיס הפתופיזיולוגיה ברמה התאית. כדי להתחיל, הפעל את לייזר הדופק כדי להבטיח שהוא יהיה מוכן לזייף ברמת הספק אופטימלית ויציבה.
כדי לחקור microtubules tissular, 10 עד 20% של כוח הלייזר הזמין משמש, אשר במערכת המתוארת מתאים 13 עד 26 מילי-וואט נמדד במישור המוקד האחורי של המטרה. לפני ההדמיה, סובבו את הלייזר ל-810 ננומטר. לאחר מכן ודא שהמיקרוסקופ מיושר על ידי קוהלר עם המטרה המשמשת לדור ההרמוני השני, או הדמיית SHG.
הסר מסננים לא רצויים מנתיב הגילוי האופטי וודא שדיאפרגמת המעבה פתוחה במלואה ושלא ניתן לעצור אור שלא לצורך. הכינו מטרת טבילה של שמן צמצם מספרי 25x על 0.8 עם טיפה קטנה של שמן טבילה בעדשה. בהמשך לשלבים המדווחים בטבלה כאן, למעט עוצמת הלייזר שהיא פחות מ-5% עבור קורנפלור.
תמונה קורנפלור יבש דחוק בין שקופיות זכוכית. עם פרמטרים של SHG ליצירת תמונות SHG, הם חושפים את כיוון קיטוב הלייזר. צלם תמונה אחת של גרגרי קורנפלור דלילים וסמן את הכיוון של אונות SHG במישור XY המתאים לכיוון קיטוב הלייזר.
לשליטה, צלם תמונה נוספת של אותה דגימה המכניסה לוחית חצי גל לנתיב האופטי כדי לשנות את כיוון התנודה של הלייזר. התמונה המתקבלת מציגה אונות אות SHG מסובבות. אם אתה משתמש במסנן פס פס אחר עבור SHG, ודא שיש לו מאפייני שידור אופטימליים על-ידי השוואת התמונות ועוצמות האות פיקסל אחר פיקסל לאורך קו הסריקה.
הכינו מגש חיץ רטט מלא בתמיסת מלח מאוזנת חמה של הנקס או HBSS. הצמידו את המוח לצלחת הדגימה באמצעות דבק ציאנואקרילט באמצעות פיסת סרט מיסוך. החלק הקאודאלי ביותר יוצר קשר עם הדבק כך שניתן לחתוך את החלקים הקורונלים השמישים מהחלק הרוסטרלי הנגדי.
העבירו את לוחית הדגימה לתמיכה המגנטית שלה בתוך מגש החיץ. התחילו לחתוך מקטעים של 300 עד 500 מיקרון עד שהפרוסות יקיפו את כל פני השטח של המוח. לאחר מכן להפחית את עובי הקטע ל 160 מיקרון.
לאחר חתך של 160 מיקרון ברמה של קורפוס קלוסום, לשחזר אותו עם פיפטה פסטר זכוכית שונה עם פתח אוגן גדול. מעבירים את החלק לצלחת פטרי נקייה עם HBSS חדש וחם או ישירות על משטח הכיסוי או צלחת תחתית הזכוכית למיקרוסקופיה. מקם את הדגימה מתחת למיקרוסקופ ומקם אותה כראוי מתחת למטרה על ידי תצפית ישירה דרך העיניים עם האור המועבר.
הסר את עודף HBSS כך שסרט נוזלי דק יכסה את כל הדגימה. בדוק חזותית את הסרט הנוזלי כל כמה דקות כדי למנוע אידוי יתר וייבוש של הדגימה. הכינו את שלב המיקרוסקופ להדמיה לא מיואשת, הכוללת סגירת כל דלתות תא הדגירה הכהה או כיסוי תא הדגירה בבד מצופה פוליאוריתן ניילון שחור.
בחר את מצב ההדמיה שאינו מיועד לאורך נתיב השידור. בדרך זו, לכידת אות SH חלש של טובולין יהיה מותאם. לאחר מכן בחר את המטרה.
לאחר מכן, הגדר עוצמת לייזר עם זמן השתהות פיקסלים של 12.6 מיקרו-שניות. צלם תמונות בגודל שאינו עולה על 512 על 512 פיקסלים במהירות חמש וממוצע שתיים לזמן רכישה ממוצע של 15 שניות. צלם תמונות תחילה באמצעות מסנן פס קצר של 485 ננומטר, ובשלב שני, הוסף מסנן פס חד של 405 ננומטר.
חותכים את המוח הקטן עם אזמל לשני חצאי כדור ומקבעים אותם לתמיכה בוויברטום על ידי החלק האמצעי. חתך ותמונה של המוח הקטן באמצעות אותן הגדרות רטט, להב ומיקרוסקופ כפי שתואר עבור המוח. כאשר הסיבים של קורפוס קלוסום הם דמיינו, מבנים קצרים דמויי סיבים ואלמנטים מעוגלים נצפים במוח taiep.
לעומת זאת, הקורפוס קלוסום של מוח הבקרה מראה אות הרבה יותר הטרוגני ואיזוטרופי בכל אזור המוח. מקורו של האות הדיפרנציאלי טמון באופן ספציפי בתופעת הדור ההרמוני השני, שכן הוספת מסנן פס הפס הצר רק מקטינה את עוצמת האות הלא ספציפית מתמונות הבקרה, תוך הסרה סלקטיבית של אות מפוזר נמוך זה מסביב למבנים דמויי סומה וקצרים מוארכים בתמונות taiep אשר תמיד מייצרים אור SH אינטנסיבי. ברקמת בקרת החומר הלבן cerebellar, היעדר מוחלט של אות SH נצפתה.
תאי Purkinje בקושי נראים בעת שימוש במסנן המעבר הקצר, והמבנים המוארכים והמעוגלים נשארים בתמונת SH מרקמת הטאייפ. שלב קריטי להשגת התמונה הטובה ביותר הוא לחתוך מקטעי רקמה דקים ככל האפשר. יתר על כן, עבודה עם מקטעי רקמה חריפים דורשת פרוטוקולים מהירים למניעת הידרדרות רקמות.
לכן, חשוב מאוד להגדיר ולבדוק את המערכת האופטית מראש. אות הרמוני שני ממיקרוטובולים חלש יותר מאות הרמוני שני מעמילן. לכן, יש להשתמש בכוח לייזר רב יותר להדמיית מיקרוטובולים.
יש להגדיל את כוח הלייזר בזהירות מכיוון שכיוון שמטרת צמצם מספרית גבוהה משמשת להדמיה, העוצמה בדגימה תגדל במהירות עם הדמיה מהדור השני, השינויים הפתולוגיים במיאלינומטיקה המרכזית של המודל הטובולינופתי מזוהים במהירות ובקלות. יישומים פוטנציאליים של טכניקה זו כוללים את השימוש בה לחקר המנגנונים הבסיסיים של טובולינופתיה H-ABC ולהערכת טיפולים פרמקולוגיים לטיפול בחולים. בטווח הארוך, לטכניקה יש פוטנציאל להפוך לכלי אבחון משלים לשימוש תוך גולגולתי או על ביופסיות טריות.
