Biyolojik numunelerin İkinci Harmonik Nesil görüntülemesi, sentrosimetrik olmayan moleküllerin ve bunların montajlarının bir etiket veya boyaya ihtiyaç duymadan görselleştirilmesini sağlayan optik bir tekniktir. Bu yöntemle üretilen görüntüler düşük arka plana sahiptir, çünkü çok az biyolojik molekül zararlı bir kuvvet olarak hareket edebilir. Bu protokol, Tubulin beta-4A'nın tanısal görüntüleme tekniğinin taiep hayvan modelinde uygulanmasını açıklamaktadır.
Tubulinopatiler son zamanlarda tanımlanan hastalıklardır. Bu nedenle, hücresel düzeyde patofizyolojinin altında yatan temel mekanizmalar hakkında sınırlı miktarda bilgi mevcuttur. Başlamak için, optimum ve sabit bir güç seviyesinde lase yapmaya hazır olacağını garanti etmek için darbeli lazeri açın.
Tissular mikrotübülleri incelemek için, mevcut lazer gücünün% 10 ila% 20'si kullanılır, bu da tarif edilen sistemde hedefin arka odak düzleminde ölçülen 13 ila 26 miliwatt'a karşılık gelir. Görüntülemeden önce, lazeri 810 nanometreye çevirin. Ardından, mikroskopun İkinci Harmonik Nesil veya SHG görüntüleme için kullanılan hedefle Koehler hizasında olduğundan emin olun.
İstenmeyen filtreleri optik algılama yolundan çıkarın ve kondenser diyaframının tamamen açıldığından ve gereksiz yere ışığın durmadığından emin olun. Lense küçük bir damla daldırma yağı ile 25x x 0,8 sayısal diyaframlı yağ daldırma hedefi hazırlayın. Mısır nişastası için% 5'ten az olan lazer gücü hariç, buradaki tabloda bildirilen adımları izleyin.
Cam slaytlar arasına sıkıştırılmış görüntü kuru mısır nişastası. SHG görüntüleri oluşturmak için SHG parametreleri ile lazer polarizasyon yönünü ortaya çıkarırlar. Seyrek mısır nişastası tanelerinin bir görüntüsünü yakalayın ve lazer polarizasyon oryantasyonuna karşılık gelen XY düzlemindeki SHG lobüllerinin yönünü işaretleyin.
Kontrol için, lazerin salınım yönünü değiştirmek için optik yola yarım dalga plakası yerleştiren aynı numunenin başka bir görüntüsünü alın. Elde edilen görüntüde döndürülmüş SHG sinyal lobülleri görüntülenir. SHG için farklı bir bant geçişi filtresi kullanıyorsanız, tarama hattı boyunca görüntüleri ve sinyal yoğunluklarını piksel piksel karşılaştırarak optimum iletim özelliklerine sahip olduğundan emin olun.
Sıcak bir Hanks'Balanced Salt Solution veya HBSS ile doldurulmuş bir vibratom tampon tepsisi hazırlayın. Beyni, bir parça maskeleme bandı aracılığıyla siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak numune plakasına sabitleyin. En kaudal kısım tutkalla temas eder, böylece karşı rostral kısımdan kullanılabilir koronal bölümler kesilebilir.
Numune plakasını tampon tepsisinin içindeki manyetik desteğine aktarın. Dilimler tüm beyin yüzeyini kapsayana kadar 300 ila 500 mikron kesitleri kesmeye başlayın. Daha sonra bölümün kalınlığını 160 mikrona düşürün.
Korpus kallozum seviyesinde 160 mikronluk bir kesit kesildikten sonra, büyük flanşlı delikli modifiye edilmiş bir cam Pasteur pipet ile geri kazanın. Bölümü, yeni sıcak HBSS ile temiz bir Petri kabına veya mikroskopi için doğrudan kapak kaymasına veya cam alt kabın üzerine aktarın. Numuneyi mikroskop altına yerleştirin ve iletilen ışıkla oküler boyunca doğrudan gözlem yaparak objektif altında uygun şekilde konumlandırın.
İnce bir sıvı filmin tüm numuneyi kaplaması için fazla HBSS'yi çıkarın. Numunenin aşırı buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için sıvı filmi birkaç dakikada bir görsel olarak kontrol edin. Mikroskop aşamasını, karanlık inkübasyon odasının tüm kapılarını kapatmayı veya inkübasyon odasını siyah naylon poliüretan kaplı bir kumaşla kaplamayı içeren taranmamış görüntüleme için hazırlayın.
İletim yolu boyunca taranmamış görüntüleme modunu seçin. Bu şekilde, tübülinin zayıf SH sinyalinin yakalanması optimize edilecektir. Ardından reklam verme amacını seçin.
Ardından, 12,6 mikrosaniyelik piksel bekleme süresine sahip bir lazer gücü ayarlayın. Ortalama 15 saniyelik bir edinme süresi için beş hız ve ortalama iki piksel ile 512 x 512 pikselden daha büyük olmayan görüntüler çekin. Önce 485 nanometre kısa geçiş filtresi kullanarak görüntüleri yakalayın ve ikinci adımda keskin bir 405 nanometre bant geçişi filtresi ekleyin.
Beyinciğin bir neşterle iki yarım küreye kesilmesi ve orta kısımla vibratom desteğine sabitlenmesidir. Beyin için tarif edildiği gibi aynı vibratom, bıçak ve mikroskop ayarlarını kullanarak beyinciği kesitleyin ve görüntüleyin. Korpus kallozumun lifleri görüntülendiğinde, taiep beyninde lif benzeri kısa yapılar ve yuvarlak elemanlar gözlenir.
Buna karşılık, kontrol beyninin korpus kallozumu, beyin bölgesi boyunca çok daha heterojen ve izotropik bir sinyal gösterir. Diferansiyel sinyalin kökeni özellikle İkinci Harmonik Üretim fenomeninde yatmaktadır, çünkü dar bant geçişi filtresinin eklenmesi yalnızca kontrol görüntülerinden spesifik olmayan sinyal yoğunluğunu azaltırken, bu düşük dağınık sinyali soma benzeri çevreden seçici olarak ve taiep görüntülerindeki kısa uzatılmış yapıları seçici olarak ortadan kaldırır. her zaman yoğun SH ışığı üretir. Serebellar beyaz cevher kontrol dokusunda, SH sinyalinin tamamen yokluğu gözlendi.
Kısa geçiş filtresi kullanılırken Purkinje hücreleri zar zor görülebilir ve uzatılmış ve yuvarlatılmış yapılar SH görüntüsünde taiep dokusundan devam eder. En iyi görüntüyü elde etmek için kritik bir adım, doku kesitlerini mümkün olduğunca ince kesmektir. Ayrıca, akut doku kesitleriyle çalışmak, doku bozulmasını önlemek için hızlı protokoller gerektirir.
Bu nedenle, optik sistemi önceden kurmak ve kontrol etmek çok önemlidir. Mikrotübüllerden gelen ikinci harmonik sinyal, nişastadan gelen ikinci harmonik sinyalden daha zayıftır. Bu nedenle, mikrotübülleri görüntülemek için daha fazla lazer gücü kullanılmalıdır.
Lazer gücü dikkatli bir şekilde arttırılmalıdır, çünkü görüntüleme için yüksek sayısal açıklık hedefi kullanıldığından, numunedeki yoğunluk hızla artacaktır İkinci Harmonik Nesil görüntüleme ile, tübülinopatik modelin merkezi miyelinomatiğindeki patolojik değişiklikler hızlı ve kolay bir şekilde tanımlanır. Bu tekniğin potansiyel uygulamaları, H-ABC tübülinopatisinin temel mekanizmalarının incelenmesi ve hastaları tedavi etmek için farmakolojik tedavilerin değerlendirilmesi için kullanımını içerir. Uzun vadede, teknik intrakraniyal olarak veya taze biyopsilerde kullanılmak üzere ücretsiz bir tanı aracı olma potansiyeline sahiptir.
