A imagem de segunda geração harmônica de amostras biológicas é uma técnica óptica que permite a visualização de moléculas não centrossimétricas e suas montagens sem a necessidade de uma etiqueta ou um corante. As imagens geradas com este método têm baixo fundo, uma vez que muito poucas moléculas biológicas poderiam atuar como uma força harmonal. Este protocolo descreve a aplicação da técnica de diagnóstico por imagem da tubulina beta-4A no modelo animal taiep.
As tubulinopatias são doenças recentemente descritas. Por esta razão, uma quantidade limitada de informações está disponível sobre os mecanismos básicos subjacentes à fisiopatologia a nível celular. Para começar, ligue o laser de pulso para garantir que ele estará pronto para lascar em um nível de potência ideal e estável.
Para estudar os microtúbulos tissulares, utiliza-se 10 a 20% da potência laser disponível, que no sistema descrito corresponde a 13 a 26 miliwatts medidos no plano focal posterior da objetiva. Antes da imagem, gire o laser para 810 nanômetros. Em seguida, certifique-se de que o microscópio esteja alinhado com Koehler com o objetivo usado para a Segunda Geração Harmônica, ou imagem SHG.
Remova os filtros indesejados do caminho de detecção óptica e certifique-se de que o diafragma do condensador esteja totalmente aberto e que nenhuma luz seja parada desnecessariamente. Prepare uma objetiva de imersão em óleo de abertura numérica de 25x por 0,8 com uma pequena gota de óleo de imersão na lente. Seguindo os passos indicados na tabela aqui, com excepção da potência do laser que é inferior a 5% para o amido de milho.
Imagem amido de milho seco ensanduichado entre lâminas de vidro. com parâmetros SHG para gerar imagens SHG, eles revelam a direção de polarização do laser. Capture uma imagem de grãos esparsos de amido de milho e marque a orientação dos lóbulos SHG no plano XY correspondente à orientação de polarização do laser.
Para controle, pegue outra imagem da mesma amostra inserindo uma placa de meia onda no caminho óptico para alterar a direção de oscilação do laser. A imagem resultante exibe lóbulos de sinal SHG rotacionados. Se estiver usando um filtro passa-banda diferente para o SHG, certifique-se de que ele tenha propriedades de transmissão ideais comparando as imagens e as intensidades de sinal pixel a pixel ao longo da linha de varredura.
Prepare uma bandeja tampão vibratome cheia com uma solução de sal balanceada de Hanks ou HBSS quente. Fixe o cérebro à placa da amostra usando cola de cianoacrilato através de um pedaço de fita adesiva. A porção mais caudal entra em contato com a cola para que as seções coronais utilizáveis da porção rostral oposta possam ser cortadas.
Transfira a placa da amostra para o seu suporte magnético dentro da bandeja tampão. Comece a cortar seções de 300 a 500 mícrons até que as fatias abranjam toda a superfície do cérebro. Em seguida, reduza a espessura da seção para 160 mícrons.
Uma vez que uma seção de 160 mícrons é cortada no nível do corpo caloso, recupere-a com uma pipeta Pasteur de vidro modificada com um grande orifício flangeado. Transfira a seção para uma placa de Petri limpa com novo HBSS quente ou diretamente para a folha de cobertura ou prato de fundo de vidro para microscopia. Coloque a amostra sob o microscópio e posicione-a adequadamente sob a objetiva por observação direta através dos óculos com luz transmitida.
Remova o excesso de HBSS para que uma película líquida fina cubra toda a amostra. Verifique visualmente o filme líquido a cada poucos minutos para evitar a evaporação excessiva e a secagem da amostra. Prepare o estágio do microscópio para imagens não desenterradas, o que inclui fechar todas as portas da câmara de incubação escura ou cobrir a câmara de incubação com um tecido revestido de poliuretano de nylon preto.
Selecione o modo de imagem não desmarcado ao longo do caminho de transmissão. Desta forma, a captura do sinal SH fraco da tubulina será otimizada. Em seguida, selecione o objetivo.
Em seguida, defina uma potência do laser com um tempo de permanência de pixels de 12,6 microssegundos. Tire imagens não maiores que 512 por 512 pixels com velocidade cinco e média de dois para um tempo médio de aquisição de 15 segundos. Capture imagens primeiro usando um filtro passa-curta de 485 nanômetros e, em uma segunda etapa, adicione um filtro passa-banda nítido de 405 nanômetros.
Corte o cerebelo com um bisturi em dois hemisférios e fixe-os ao suporte do vibratome pela porção média. Seção e imagem do cerebelo usando as mesmas configurações de vibratome, lâmina e microscópio descritas para o cérebro. Quando as fibras do corpo caloso são fotografadas, estruturas curtas semelhantes a fibras e elementos arredondados são observados no cérebro taiep.
Em contraste, o corpo caloso do cérebro de controle mostra um sinal muito mais heterogêneo e isotrópico em toda a região do cérebro. A origem do sinal diferencial reside especificamente no fenômeno da Segunda Geração Harmônica, uma vez que a adição do filtro passa-banda estreito apenas diminui a intensidade do sinal não específico das imagens de controle, enquanto remove seletivamente esse sinal difuso baixo de todo o soma-like e as estruturas alongadas curtas nas imagens taiep que sempre geram luz intensa SH. No tecido controle da substância branca cerebelar, observou-se ausência completa de sinal de HAS.
As células de Purkinje são pouco visíveis quando se usa o filtro passa-curto, e as estruturas alongadas e arredondadas persistem na imagem SH do tecido taiep. Um passo crítico para obter a melhor imagem é cortar as seções de tecido o mais finas possível. Além disso, trabalhar com cortes de tecido agudo requer protocolos rápidos para evitar a deterioração do tecido.
Portanto, é crucial configurar e verificar o sistema óptico de antemão. O segundo sinal harmônico dos microtúbulos é mais fraco do que o segundo sinal harmônico do amido. Portanto, mais potência do laser deve ser usada para obter microtúbulos de imagem.
A potência do laser deve ser aumentada com cuidado porque, como uma objetiva de alta abertura numérica é usada para imagens, a intensidade na amostra aumentaria rapidamente Com a imagem de Segunda Geração Harmônica, as alterações patológicas na mielinimática central do modelo tubulinopático são rápida e facilmente identificadas. Potenciais aplicações desta técnica incluem o seu uso para o estudo dos mecanismos básicos da tubulinopatia H-ABC e para a avaliação de terapias farmacológicas para tratar pacientes. A longo prazo, a técnica tem o potencial de se tornar uma ferramenta diagnóstica complementar a ser usada por via intracraniana ou em biópsias recentes.
