通过可见光光解 核 黄素-5′-磷酸灭活病原体

该方案使用可见紫光照射来诱导黄素单核苷酸光解。这会产生大量的自由基，抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等致病菌。我们已经测试了黄素单核苷酸作为合适的光敏剂。

在这个协议中，我们使用可见的紫光，这是安全的，不需要昂贵的设备。该方法可用于通过插入光纤进行照明来治疗受伤的皮肤或感染的皮下组织。它也可以应用于食品工业的卫生实践。

演示该程序的是我实验室的研究生Tang-Yu Chen 首先，在不透明的塑料杯内侧安装六个12伏的发光二极管。取直径为13毫米，高度为100毫米的玻璃试管，将反应物加入试管中。将管子固定在杯子顶部，并将此设置置于 25 三摄氏度的恒定温度下。

通过红外测温仪在整个光解反应过程中监测和记录测试单元的温度。接下来，在pH 7.8的100毫摩尔磷酸钾缓冲液中制备0.1毫摩尔FMN溶液。将三毫升FMN样品分别暴露在蓝色，绿色，红色或紫色光下五分钟。

同时，将三毫升FMN溶液置于黑暗中作为对照。将样品放入紫外可见分光光度计中，并在250至750纳米范围内记录辐照样品的吸光度。为了准备检测超氧自由基，首先在pH 7.8下将109.3毫克L-蛋氨酸加入73.3毫升100毫摩尔磷酸盐缓冲液中。

在溶液中加入10毫克NBT粉末和1.5毫升0.117毫摩尔FMN。将一毫升反应溶液暴露在蓝色或紫色LED灯下一到五分钟。记录516纳米的吸光度以检测由NBT的光化学反应产生的甲胺。

将金黄色葡萄球菌菌落接种到15毫升螺旋盖试管中的10毫升溶原肉汤中。在摇床中在 37 摄氏度下培养培养物 16 小时。将0.5毫升培养物转移到1.5毫升离心管中。

通过加入灭菌水，将培养物稀释至600纳米处的0.5光密度。然后，将0.5毫升培养物转移到1.5毫升离心管中。以14， 000g离心10分钟，倒出上清液。

向细胞沉淀中加入一毫升FMN缓冲溶液并涡旋。对于辐照对照，加入一毫升磷酸盐缓冲液。将一毫升含有30微摩尔FMN和磷酸盐缓冲液的细菌细胞溶液转移到玻璃管中。

将它们以每平方米 10 瓦的紫光照射 30 分钟。然后，在玻璃管中转移一毫升含有30-60和120微摩尔FMN和磷酸盐缓冲液的细菌细胞溶液。用蓝光照射 120 分钟，每平方米 20 瓦。

此外，将含有一毫升 120 微摩尔 FMN 的管照射 60 分钟。照射后，将0.2毫升反应溶液加入luria琼脂平板上。使用L形玻璃棒铺开溶液，并在37摄氏度下孵育过夜。

第二天，计算金黄色葡萄球菌的活板计数和灭活率。如前所述制备金黄色葡萄球菌样品以获得细胞沉淀。向75毫升磷酸盐缓冲液中加入0.1093克L-蛋氨酸，0.1克NBT和25毫升FMN溶液。

向细胞沉淀和涡旋中加入一毫升具有不同FMN浓度的每种反应物溶液。在紫光下以每平方米10瓦的功率照射溶液10分钟。将混合物以14， 000g离心10分钟，然后倒出上清液。

将沉淀重悬于一毫升二甲基亚砜中以提取还原的NBT。记录560纳米处的吸光度。与暗对照相比，用绿光和红光照射FMN对372和444纳米处的峰没有影响，而在蓝光和紫光下观察到FMN在444纳米处的吸光度降低，表明光解增加。

使用NBT还原法检测在蓝色或紫色光下FMN光解过程中形成的超氧自由基。FMN的光化学效应取决于辐照时间。使用蓝色或紫色光照射的FMN光解导致金黄色葡萄球菌显着失活。

在蓝光照射下观察到剂量依赖性灭活，120微摩尔FMN的灭活达到97%。在紫光下，金黄色葡萄球菌的灭活率为96%，其中30 μmol FMN对细菌灭活的疗效更高。NBT还原表明，紫光下FMN对金黄色葡萄球菌的光解作用与FMN浓度成正比。

在未处理的条件下，560纳米处的吸光度较低，表明超氧自由基的丰度较低，而FMN处理中较高的吸光度值表明超氧自由基的产生量很大，从而导致光化学效应增加。拥有良好的LED光源至关重要。紫光范围的光谱宽度必须较窄，以避免与紫外线吸收重叠，因为紫外线辐射可能是危险的。

在该程序之后，可以测试其他化合物，例如四环素，多西环素，儿茶素，并可以测试类似于FMN的光解。