用于泪腺干细胞的三维无血清培养系统

该方案为富集泪腺干细胞以再生和重建泪腺提供了有利的策略。泪腺干细胞显示出长期的扩增能力和分化的潜力。该技术的主要优点是泪腺干细胞培养基无血清，这表明泪腺修复的巨大价值 首先获得安乐死的6至8周龄BALB / c雄性小鼠并切割耳后的皮肤以暴露泪腺及其周围的结缔组织。

在镊子的帮助下，通过钝性解剖剥离结缔组织，并去除泪腺。将泪腺浸入装有4毫升75%乙醇的6厘米培养皿中10秒钟，并立即用10毫升PBS溶液冲洗两次。将泪腺切成约一毫米立方的小碎片。

将它们转移到无菌的15毫升离心管中，并在37摄氏度下用500微升每毫升25单位的分散酶和500微升的0.1%胶原酶I处理组织一小时。用一毫升0.05%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下处理泪腺碎片10分钟，并通过反复移液将碎片解离成单个细胞。通过70微米过滤器过滤悬浮液，将过滤器收集到无菌的15毫升离心管中，并在150倍G下离心5分钟。

离心后，取出上清液，加入10毫升10毫升PBS溶液洗涤细胞沉淀，并将悬浮液以150倍G离心5分钟。重复洗涤细胞沉淀。然后，除去上清液，加入1毫升1:1比例的杜尔贝茨科改性鹰培养基和汉姆的F-12，以重悬细胞沉淀。

在24孔板的孔中心加入20微升基质凝胶泪腺干细胞培养基质。使用移液器吸头将其扩大到直径约6至8毫米的圆圈，并将混合物在37摄氏度下孵育20分钟以预涂孔。使用细胞计数器确定细胞数量，并将40微升泪腺干细胞培养基或LGSCM加入总共10， 000个细胞到40微升基质凝胶中。

用移液管轻轻混合。使用移液管小心地将80微升的混合物滴在24孔板的每个孔的预涂膜区域上。将混合物在37摄氏度下孵育20分钟，并加入600微升LGSCM。

每两天更换一次每个孔中的培养基。经过七天的培养，在倒置显微镜下寻找直径为100至300微米的LGSC球体。使用该方案分离和培养Rosa26和NOD小鼠的原发性泪腺干细胞。

培养7天后，从球体培养井中取出培养基。通过在20微升每毫升分散酶10单位和100微升10毫升PBS中在37摄氏度下孵育30分钟来分解LGSC球。将悬浮液转移到15毫升离心管中，并以150倍G离心4分钟。

取出上清液。用一毫升0.05%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下处理球体五分钟，加入一毫升0.05%胰蛋白酶抑制剂并反复移液以中和胰蛋白酶并将球体解离成单细胞。在150倍G下离心五分钟，并除去上清液以沉淀LGSC。

加入一毫升LGSCM以重悬泪腺干细胞沉淀并如上所述接种细胞。如果执行程序一，使用泪腺干细胞培养系统将LGSC的培养时间从7天延长至14天，以进行随机分化。对于程序二，在泪腺干细胞培养开始时将基质凝胶与LGSCM的比例从1:1更改为1:2，用于导管细胞的分化。

将泪腺干细胞接种到基质中以进行诱导14天。对于程序三，传代后，用LGSCM 10%FBS代替LGSCM以分化腺泡细胞。诱导分化 14 天。

经过一周的培养，Kr14和Ki67在泪腺干细胞形成的所有球体中表达。球体的直径达到100微米。苏木精和曙红染色在第七天显示出细胞性。

原代培养和传代培养7 d后获得的泪腺干细胞富集因子表明，该方法富集的细胞具有较强的增殖能力。在这个系统中，泪腺干细胞可以传代超过40次，并且仍然保持干细胞特征。通过胎牛血清和低比例基质凝胶诱导泪腺干细胞形成更多芽。

苏木精和曙红染色表明，胎牛血清可以诱导球体产生更多的空化结构。在NOD小鼠中原位注射罗莎泪腺干细胞后，在泪腺附近形成新的泪腺小叶。小叶大部分由AQP5高表达的成熟腺泡细胞组成，小叶内形成，AQP5表达率低。

罗莎泪腺干细胞注射侧的泪液分泌量高于对照侧，但低于野生型小鼠基质凝胶及其相关混合物在使用前必须始终保持在冰上，并且与基质凝胶接触的微量离心管和吸头应预冷。该系统为进一步研究泪腺干细胞、泪腺修复和泪腺疾病的药物筛选提供了理想的模型。