Dreidimensionales, serumfreies Kultursystem für Tränendrüsenstammzellen

Dieses Protokoll bietet eine vorteilhafte Strategie zur Anreicherung von Tränendrüsenstammzellen für die Regeneration und Rekonstruktion der Tränendrüse. Tränendrüsenstammzellen zeigen eine langfristige Expansionskapazität und das Potenzial der Differenzierung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das Kulturmedium für Tränendrüsenstammzellen serumfrei ist, was den enormen Wert für die Reparatur der Tränendrüse zeigt Beginnen Sie, indem Sie eine sechs bis acht Wochen alte BALB / c-männliche Maus erhalten und die Haut hinter dem Ohr schneiden, um die Tränendrüse und das sie umgebende Bindegewebe freizulegen.

Ziehen Sie das Bindegewebe durch stumpfe Dissektion mit Hilfe einer Pinzette ab und entfernen Sie die Tränendrüse. Tauchen Sie die Tränendrüsen 10 Sekunden lang in eine sechs Zentimeter große Schale mit vier Millilitern 75% Ethanol und spülen Sie sie sofort zweimal mit 10-Millimolar-PBS-Lösung ab. Schneiden Sie die Tränendrüsen in kleine Fragmente von etwa einem Millimeter gewürfelt.

Geben Sie sie in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und behandeln Sie das Gewebe mit 500 Mikrolitern von 25 Einheiten pro Milliliterdispase und 500 Mikrolitern 0,1% Kollagenase I für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Behandeln Sie die Tränendrüsenfragmente mit einem Milliliter 0,05% Trypsin EDTA für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und dissoziieren Sie die Fragmente in einzelne Zellen durch wiederholtes Pipettieren. Filtern Sie die Suspension durch einen 70-Mikrometer-Filter, sammeln Sie den Filter in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 150 mal G.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, fügen Sie 10 Milliliter 10-millimolare PBS-Lösung hinzu, um das Zellpellet zu waschen, und zentrifugieren Sie die Suspension bei 150 mal G für fünf Minuten. Wiederholen Sie das Waschen des Zellpellets. Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie einen Milliliter eines Verhältnisses von 1: 1 von Dulbecco's Modified Eagles Medium und Ham's F-12 hinzu, um die Zellpellets zu resuspendieren.

Fügen Sie 20 Mikroliter Matrix-Gel-Tränendrüsen-Stammzell-Medium-Matrix in der Mitte des Brunnens einer 24-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um sie auf einen Kreis von etwa sechs bis acht Millimetern Durchmesser auszudehnen, und inkubieren Sie die Mischung für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius, um den Brunnen vorzubeschichten. Verwenden Sie einen Zellzähler, um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, und fügen Sie 40 Mikroliter Tränendrüsenstammzellmedium oder LGSCM mit insgesamt 10.000 Zellen in 40 Mikroliter des Matrixgels hinzu.

Mischen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette. Verwenden Sie eine Pipette, um 80 Mikroliter der Mischung vorsichtig über den vorbeschichteten Bereich in jeder Vertiefung der 24-Well-Platte fallen zu lassen. Inkubieren Sie die Mischung für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und fügen Sie 600 Mikroliter LGSCM hinzu.

Wechseln Sie das Kulturmedium in jedem Brunnen alle zwei Tage. Suchen Sie nach sieben Tagen Kultur nach LGSC-Kugeln mit einem Durchmesser von 100 bis 300 Mikrometern unter dem inversen Mikroskop. Verwenden Sie dieses Protokoll, um primäre Tränendrüsenstammzellen von Rosa26- und NOD-Mäusen zu isolieren und zu kultivieren.

Nach sieben Tagen Kultur das Kulturmedium aus der Sphäre Kultur gut entfernen. Disaggregieren Sie die LGSC-Kugeln durch Inkubation in 20 Mikroliter von 10 Einheiten pro Milliliter Dispase und 100 Mikroliter 10-Millimolar PBS für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Suspension vier Minuten lang auf ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und eine Zentrifuge bei 150 x G.

Entfernen Sie den Überstand. Behandeln Sie die Kugeln mit einem Milliliter 0,05% Trypsin EDTA für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius Fügen Sie einen Milliliter 0,05% Trypsin-Inhibitor hinzu und pipettieren Sie wiederholt, um das Trypsin zu neutralisieren und die Kugeln in einzelne Zellen zu dissoziieren. Zentrifugieren Sie bei 150 mal G für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand, um die LGSCs zu pelletieren.

Fügen Sie einen Milliliter LGSCM hinzu, um das Stammzellpellet der Tränendrüse zu resuspendieren und die Zellen zu beschichten, wie zuvor gezeigt. Wenn Sie das erste Verfahren durchführen, verlängern Sie die Kulturzeit der LGSCs von sieben auf 14 Tage mit dem Tränendrüsen-Stammzellkultursystem zur zufälligen Differenzierung. Für das zweite Verfahren ändern Sie das Verhältnis des Matrixgels zu LGSCM von 1:1 auf 1:2 zu Beginn der Tränendrüsen-Stammzellkultur zur Differenzierung der duktalen Zellen.

Samen Sie die Tränendrüsenstammzellen in die Matrix zur Induktion für 14 Tage. Für Verfahren drei, nach der Passage, ersetzen Sie die LGSCM durch LGSCM 10% FBS zur Differenzierung von Acinarenzellen. Differenzierung für 14 Tage induzieren.

Nach einer Woche Kultur wurden Kr14 und Ki67 in allen Sphären exprimiert, die von Tränendrüsenstammzellen gebildet wurden. Die Kugeln erreichten einen Durchmesser von 100 Mikrometern. Hämatoxylin- und Eosinfärbungen zeigten am siebten Tag Zellularität.

Die Anreicherungsfaktoren von Tränendrüsenstammzellen, die nach sieben Tagen Primärkultur und Subkultur gewonnen wurden, deuteten darauf hin, dass die mit dieser Methode angereicherten Zellen eine starke proliferative Fähigkeit aufwiesen. In diesem System könnten Tränendrüsenstammzellen über 40 Mal durchgangen werden und dennoch Stammzelleigenschaften beibehalten. Tränendrüsenstammzellen wurden durch fetales Rinderserum und einen geringen Anteil an Matrixgel dazu gebracht, mehr Knospen zu bilden.

Hämatoxylin- und Eosinfärbungen deuteten darauf hin, dass fetales Rinderserum die Kugeln dazu bringen könnte, mehr kavitierende Strukturen zu produzieren. Nach der orthotopen Injektion von Rosa-Tränendrüsenstammzellen in NOD-Mäuse wurden neue Tränenläppchen neben den Tränendrüsen gebildet. Die meisten Läppchen bestanden aus reifen Acinarenzellen mit hoher Expression von AQP5 und es gab eine intralobuläre Kanalbildung mit niedriger AQP5-Expression.

Die Menge an Tränensekretion auf der Injektionsseite der Rosa-Tränendrüsenstammzellen war höher als auf der Kontrollseite, aber niedriger als bei den Wildtyp-Mäusen Das Matrixgel und die zugehörige Mischung müssen vor dem Gebrauch immer auf Eis gehalten werden und das Mikrozentrifugenröhrchen und die Spitzen in Kontakt mit Matrixgel sollten vorgekühlt werden. Das System bietet ein ideales Modell für die weitere Untersuchung von Tränendrüsenstammzellen, die Reparatur von Tränendrüsen und das Arzneimittelscreening auf Tränendrüsenerkrankungen.