يوفر هذا البروتوكول استراتيجية مفيدة لإثراء الخلايا الجذعية للغدة الدمعية لتجديد وإعادة بناء الغدة الدمعية. تظهر الخلايا الجذعية للغدة الدمعية قدرة توسع طويلة الأجل وإمكانات التمايز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الوسط الزرعي للخلايا الجذعية للغدة الدمعية خال من المصل ، مما يدل على القيمة الهائلة لإصلاح الغدة الدمعية ابدأ بالحصول على فأر ذكر BALB / c يبلغ من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع وقطع الجلد خلف الأذن لفضح الغدة الدمعية والنسيج الضام من حولها.
قشر النسيج الضام عن طريق تشريح حاد بمساعدة ملاقط وإزالة الغدة الدمعية. اغمر الغدد الدمعية في طبق طوله ستة سنتيمترات مع أربعة ملليلترات من الإيثانول بنسبة 75٪ لمدة 10 ثوان وشطفها على الفور بمحلول PBS 10 ملليمولار مرتين. قطع الغدد الدمعية إلى شظايا صغيرة من حوالي ملليمتر واحد مكعب.
انقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلتر وعالج الأنسجة ب 500 ميكرولتر من 25 وحدة لكل ملليلتر ديسباز و 500 ميكرولتر من 0.1٪ كولاجيناز I لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. عالج شظايا الغدة الدمعية بملليلتر واحد من 0.05٪ من التربسين EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية وقم بفصل الشظايا إلى خلايا مفردة عن طريق السحب بشكل متكرر. قم بتصفية التعليق من خلال مرشح 70 ميكرومتر ، وجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلتر ، وأجهزة طرد مركزي بسرعة 150 مرة G لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة السوبرنات ، وأضف 10 ملليلتر من محلول PBS 10 ملليمولار لغسل حبيبات الخلية ، وقم بالطرد المركزي للتعليق عند 150 مرة G لمدة خمس دقائق. كرر غسل بيليه الخلية. بعد ذلك ، قم بإزالة supernatant وإضافة ملليلتر واحد من نسبة 1: 1 من Dulbecco's Modified Eagles Medium و Ham's F-12 لإعادة تعليق كريات الخلايا.
أضف 20 ميكرولتر من مصفوفة الخلايا الجذعية للغدة الدمعية في وسط بئر صفيحة 24 بئرا. استخدم طرف ماصة لتوسيعه إلى دائرة قطرها حوالي ستة إلى ثمانية ملليمترات واحتضن الخليط لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتغطية البئر مسبقا. استخدم عداد الخلايا لتحديد عدد الخلايا وإضافة 40 ميكرولتر من وسط الخلايا الجذعية للغدة الدمعية ، أو LGSCM ، مع ما مجموعه 10،000 خلية في 40 ميكرولتر من هلام المصفوفة.
امزجها بلطف مع ماصة. استخدم ماصة لإسقاط 80 ميكرولتر من الخليط بعناية فوق المنطقة المطلية مسبقا في كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا. احتضن الخليط لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية وأضف 600 ميكرولتر من LGSCM.
تغيير الوسط الثقافي في كل بئر مرة كل يومين. بعد سبعة أيام من الثقافة ، ابحث عن كرات LGSC التي يتراوح قطرها بين 100 و 300 ميكرومتر تحت المجهر المقلوب. استخدم هذا البروتوكول لعزل وزراعة الخلايا الجذعية الأولية للغدة الدمعية لفئران Rosa26 و NOD.
بعد سبعة أيام من الثقافة ، قم بإزالة الوسط الثقافي من ثقافة المجال جيدا. قم بتصنيف كرات LGSC عن طريق الحضانة في 20 ميكرولتر من 10 وحدات لكل ملليلتر ديسباز و 100 ميكرولتر من PBS 10 ملليمولار لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر وجهاز طرد مركزي بسرعة 150 مرة G لمدة أربع دقائق.
إزالة supernatant. عالج الكرات بملليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية أضف ملليلتر واحد من مثبط التربسين 0.05٪ وماصة مرارا وتكرارا لتحييد التربسين وفصل الكرات إلى خلايا مفردة. جهاز طرد مركزي بسرعة 150 مرة G لمدة خمس دقائق وقم بإزالة السوبرنات لتكوير LGSCs.
أضف ملليلتر واحد من LGSCM لإعادة تعليق حبيبات الخلايا الجذعية للغدة الدمعية ولوحة الخلايا كما هو موضح سابقا. في حالة تنفيذ الإجراء الأول ، قم بتمديد وقت زراعة LGSCs من سبعة إلى 14 يوما باستخدام نظام زراعة الخلايا الجذعية للغدة الدمعية للتمايز العشوائي. بالنسبة للإجراء الثاني ، قم بتغيير نسبة هلام المصفوفة إلى LGSCM من 1: 1 إلى 1: 2 في بداية زراعة الخلايا الجذعية للغدة الدمعية لتمايز الخلايا القنوية.
زرع الخلايا الجذعية للغدة الدمعية في المصفوفة للحث لمدة 14 يوما. بالنسبة للإجراء الثالث ، بعد المرور ، استبدل LGSCM ب LGSCM 10٪ FBS لتمايز الخلايا الأسينارية. حث التمايز لمدة 14 يوما.
بعد أسبوع واحد من الثقافة ، تم التعبير عن Kr14 و Ki67 في جميع المجالات التي شكلتها الخلايا الجذعية للغدة الدمعية. وصلت الكرات إلى قطر 100 ميكرومتر. أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين خلوية في اليوم السابع.
أشارت عوامل إثراء الخلايا الجذعية للغدة الدمعية التي تم الحصول عليها بعد سبعة أيام من الزراعة الأولية والزراعة الفرعية إلى أن الخلايا المثرية بهذه الطريقة لديها قدرة تكاثرية قوية. في هذا النظام ، يمكن تمرير الخلايا الجذعية للغدة الدمعية أكثر من 40 مرة ولا تزال تحافظ على خصائص الخلايا الجذعية. تم حث الخلايا الجذعية للغدة الدمعية على تكوين المزيد من البراعم بواسطة مصل البقر الجنيني ونسبة منخفضة من هلام المصفوفة.
أشار تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين إلى أن مصل البقر الجنيني يمكن أن يحفز الكرات على إنتاج المزيد من الهياكل التجويفية. بعد الحقن التقويمي للخلايا الجذعية للغدة الدمعية روزا في فئران NOD ، تم تشكيل فصيصات دمعية جديدة بجوار الغدد الدمعية. كانت معظم الفصيصات تتكون من خلايا أسينار ناضجة ذات تعبير عال عن AQP5 وكان هناك تكوين قناة داخل الفصيص مع تعبير AQP5 منخفض.
كانت كمية إفراز الدموع على جانب حقن الخلايا الجذعية للغدة الدمعية روزا أعلى مما كانت عليه على جانب التحكم ، ولكنها أقل مما كانت عليه في الفئران من النوع البري يجب دائما الاحتفاظ بهلام المصفوفة والخليط المرتبط به على الجليد قبل الاستخدام ويجب تبريد أنبوب الطرد المركزي الدقيق والنصائح الملامسة لهلام المصفوفة مسبقا. يوفر النظام نموذجا مثاليا لمزيد من الدراسة للخلايا الجذعية للغدة الدمعية ، وإصلاح الغدة الدمعية ، وفحص الأدوية لأمراض الغدة الدمعية.
