Bu protokol, lakrimal bezin rejenerasyonu ve rekonstrüksiyonu için lakrimal bez kök hücrelerinin zenginleştirilmesi için avantajlı bir strateji sağlar. Lakrimal bez kök hücreleri uzun süreli genişleme kapasitesi ve farklılaşma potansiyeli gösterir. Bu tekniğin temel avantajı, lakrimal bez kök hücreleri için kültür ortamının serumsuz olmasıdır, bu da lakrimal bez onarımı için muazzam değeri gösterir Ötenazi altı ila sekiz haftalık bir BALB / c erkek fare elde ederek ve lakrimal bezi ve etrafındaki bağ dokusunu açığa çıkarmak için kulağın arkasındaki cildi keserek başlayın.
Cımbız yardımıyla künt diseksiyon ile bağ dokusunu soyun ve lakrimal bezi çıkarın. Lakrimal bezleri 10 saniye boyunca dört mililitre% 75 etanol içeren altı santimetrelik bir kaba batırın ve hemen iki kez 10 milimolar PBS çözeltisi ile durulayın. Lakrimal bezleri yaklaşık bir milimetre küp küçük parçalar halinde kesin.
Bunları steril bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve dokuları 37 santigrat derecede bir saat boyunca mililitre dispase başına 500 mikrolitre 25 ünite ve 500 mikrolitre% 0.1 kollajenaz I ile tedavi edin. Lakrimal bez fragmanlarını 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA ile tedavi edin ve parçaları tekrar tekrar pipetleyerek tek hücrelere ayırın. Süspansiyonu 70 mikrometrelik bir filtreden süzün, filtreyi steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın ve beş dakika boyunca 150 kez G'de santrifüj yapın.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın, hücre peletini yıkamak için 10 mililitre 10 milimolar PBS çözeltisi ekleyin ve süspansiyonu beş dakika boyunca 150 kez G'de santrifüj edin. Hücre peletinin yıkanmasını tekrarlayın. Ardından, süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini yeniden askıya almak için Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium ve Ham'ın F-12'sinin 1: 1 oranında bir mililitre ekleyin.
24 delikli bir plakanın kuyusunun ortasına 20 mikrolitre matris jel lakrimal bez kök hücre orta matrisi ekleyin. Yaklaşık altı ila sekiz milimetre çapında bir daireye genişletmek için bir pipet ucu kullanın ve kuyuyu önceden kaplamak için karışımı 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Hücre sayısını belirlemek için bir hücre sayacı kullanın ve matris jelinin 40 mikrolitresine toplam 10.000 hücre içeren 40 mikrolitre lakrimal bez kök hücre ortamı veya LGSCM ekleyin.
Onları bir pipetle nazikçe karıştırın. Karışımın 80 mikrolitresini, 24 delikli plakanın her bir kuyuğundaki önceden kaplanmış alanın üzerine dikkatlice bırakmak için bir pipet kullanın. Karışımı 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin ve 600 mikrolitre LGSCM ekleyin.
Her kuyucuktaki kültür ortamını iki günde bir değiştirin. Yedi günlük kültürden sonra, ters çevrilmiş mikroskop altında çapı 100 ila 300 mikrometre olan LGSC kürelerini arayın. Rosa26 ve NOD farelerinin primer lakrimal bez kök hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için bu protokolü kullanın.
Yedi günlük kültürden sonra, kültür ortamını küre kültüründen iyice çıkarın. LGSC kürelerini, mililitre dispase başına 20 mikrolitre 10 ünite ve 100 mikrolitre 10 milimolar PBS'de 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübasyon yoluyla ayrıştırın. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve dört dakika boyunca 150 kez G'de santrifüj yapın.
Süper natantı çıkarın. Küreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA ile tedavi edin Tripsini nötralize etmek ve küreleri tek hücrelere ayırmak için tekrar tekrar bir mililitre% 0.05 tripsin inhibitörü ve pipet ekleyin. Beş dakika boyunca 150 kez G'de santrifüj yapın ve LGSC'leri peletlemek için süpernatantı çıkarın.
Lakrimal bez kök hücre peletini yeniden askıya almak için bir mililitre LGSCM ekleyin ve hücreleri daha önce gösterildiği gibi plakalayın. Birinci prosedürü uygularsanız, rastgele farklılaşma için lakrimal bez kök hücre kültürü sistemi ile LGSC'lerin kültür süresini yedi ila 14 güne uzatın. İkinci prosedür için, duktal hücrelerin farklılaşması için lakrimal bez kök hücre kültürünün başlangıcında matris jelinin LGSCM'ye oranını 1: 1'den 1: 2'ye değiştirin.
Lakrimal bez kök hücrelerini 14 gün boyunca indüksiyon için matrise tohumlayın. Üçüncü prosedür için, geçişten sonra, asinar hücrelerin farklılaşması için LGSCM'yi LGSCM% 10 FBS ile değiştirin. 14 gün boyunca farklılaşmayı indükleyin.
Bir haftalık kültürden sonra, Kr14 ve Ki67, lakrimal bez kök hücreleri tarafından oluşturulan tüm kürelerde eksprese edildi. Küreler 100 mikrometre çapa ulaştı. Hematoksilin ve eozin boyaması yedinci günde hücresellik gösterdi.
Yedi günlük primer kültür ve alt kültürden sonra elde edilen lakrimal bez kök hücrelerinin zenginleştirme faktörleri, bu yöntemle zenginleştirilen hücrelerin güçlü bir proliferatif yeteneğe sahip olduğunu göstermiştir. Bu sistemde, lakrimal bez kök hücreleri 40 kattan fazla geçiş yapabilir ve hala kök hücre özelliklerini koruyabilir. Lakrimal bez kök hücreleri, fetal sığır serumu ve düşük oranda matriks jel ile daha fazla tomurcuk oluşturmaya teşvik edildi.
Hematoksilin ve eozin boyaması, fetal sığır serumunun küreleri daha fazla kavitasyon yapısı üretmeye teşvik edebileceğini göstermiştir. NOD farelerde Rosa lakrimal bez kök hücrelerinin ortotopik enjeksiyonundan sonra, lakrimal bezlere bitişik yeni lakrimal lobüller oluşturuldu. Lobüllerin çoğu yüksek AQP5 ekspresyonuna sahip olgun asinar hücrelerden oluşuyordu ve düşük AQP5 ekspresyonu ile intralobüler kanal oluşumu vardı.
Rosa lakrimal bezi kök hücre enjeksiyon tarafındaki gözyaşı sekresyon miktarı kontrol tarafına göre daha yüksekti, ancak vahşi tip farelerden daha düşüktü Matriks jeli ve ilgili karışımı kullanımdan önce daima buz üzerinde tutulmalı ve matris jeli ile temas eden mikrosantrifüj tüpü ve uçları önceden soğutulmalıdır. Sistem, lakrimal bez kök hücrelerinin daha fazla incelenmesi, lakrimal bez onarımı ve lakrimal bez hastalıkları için ilaç taraması için ideal bir model sunmaktadır.
