このプロトコールは、涙腺の再生および再構築のために涙腺幹細胞を富化するための有利な戦略を提供する。涙腺幹細胞は、長期的な拡張能力および分化の可能性を示す。この技術の主な利点は、涙腺幹細胞の培養培地が無血清であることであり、これは涙腺修復のための莫大な価値を示す 安楽死させた6〜8週齢のBALB / c男性マウスを入手し、耳の後ろの皮膚を切断して涙腺とその周囲の結合組織を露出させることから始める。
ピンセットの助けを借りて鈍い解剖によって結合組織を剥がし、涙腺を除去する。涙腺を4ミリリットルの75%エタノールを含む6センチメートルの皿に10秒間浸し、直ちに10ミリモルのPBS溶液で2回すすいでください。涙腺を約1ミリメートル立方体の小さな断片に切る。
それらを滅菌15ミリリットル遠沈管に移し、500マイクロリットルの25単位/ミリリットルのディスパーゼおよび500マイクロリットルの0.1%コラゲナーゼIで摂氏37度で1時間組織を処理する。涙腺断片を1ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAで摂氏37度で10分間処理し、ピペッティングを繰り返して断片を単一細胞に解離させる。懸濁液を70マイクロメートルのフィルターでろ過し、フィルターを滅菌15ミリリットルの遠沈管に集め、150倍Gで5分間遠心分離する。
遠心分離後、上清を取り出し、10ミリリットルの10ミリモルPBS溶液を加えて細胞ペレットを洗浄し、懸濁液を150倍Gで5分間遠心分離した。細胞ペレットの洗浄を繰り返す。次に、上清を除去し、ダルベッコの改変イーグルス培地とハムのF-12の1:1比の1ミリリットルを加えて、細胞ペレットを再懸濁する。
20マイクロリットルのマトリックスゲル涙腺幹細胞培地マトリックスを24ウェルプレートのウェルの中央に加える。ピペットチップを使用して直径約6〜8ミリメートルの円に拡大し、混合物を摂氏37度で20分間インキュベートしてウェルをプレコートします。セルカウンターを使用して細胞数を決定し、40マイクロリットルの涙腺幹細胞培地(LGSCM)を合計10,000個の細胞とともに40マイクロリットルのマトリックスゲルに加える。
ピペットで優しく混ぜる。ピペットを使用して、24ウェルプレートの各ウェルのプレコート領域に80マイクロリットルの混合物を慎重に滴下します。混合物を摂氏37度で20分間インキュベートし、600マイクロリットルのLGSCMを加える。
各ウェルの培養液は2日に1回交換する。7日間の培養後、倒立顕微鏡下で直径100〜300マイクロメートルのLGSCスフェアを探します。このプロトコルを使用して、Rosa26およびNODマウスの初代涙腺幹細胞を単離および培養する。
7日間の培養後、スフェア培養ウェルから培養液を除去する。摂氏37度で30分間、20マイクロリットルの1ミリリットル当たり10単位のディスパーゼおよび100マイクロリットルの10ミリモルPBS中でインキュベートすることによってLGSC球体を分解する。懸濁液を15ミリリットルの遠沈管に移し、150倍Gで4分間遠心分離する。
上清を除去する。1ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAで37°Cで5分間スフェアを処理し、1ミリリットルの0.05%トリプシン阻害剤とピペットを繰り返し加えてトリプシンを中和し、スフェアを単一細胞に解離させる。150回Gで5分間遠心分離し、上清を除去してLGSCをペレット化する。
1ミリリットルのLGSCMを加えて涙腺幹細胞ペレットを再懸濁させ、前述のように細胞をプレートする。手順1を行う場合、ランダム分化のための涙腺幹細胞培養系を用いてLGSCsの培養時間を7日から14日間に延長する。手順2については、管細胞の分化のための涙腺幹細胞培養の開始時に、マトリックスゲルとLGSCMの比を1:1から1:2に変更する。
涙腺幹細胞をマトリックスに播種し、誘導のために14日間行う。手順3については、継代後、腺房細胞の分化のためにLGSCMをLGSCM 10%FBSと交換する。14日間分化を誘導する。
培養の1週間後、Kr14およびKi67は、涙腺幹細胞によって形成された全てのスフェアにおいて発現した。球体は直径100マイクロメートルに達した。ヘマトキシリンおよびエオジン染色は、7日目に細胞性を示した。
初代培養及び継代培養の7日後に得られた涙腺幹細胞の富化因子は、この方法により濃縮された細胞が強い増殖能を有することを示した。このシステムでは、涙腺幹細胞を40回以上継代することができ、依然として幹細胞特性を維持することができる。涙腺幹細胞は、ウシ胎児血清および低い割合のマトリックスゲルによってより多くの芽を形成するように誘導された。
ヘマトキシリンおよびエオジン染色は、ウシ胎児血清が球体を誘導してより多くのキャビテーション構造を産生し得ることを示した。NODマウスにおけるRosa涙腺幹細胞の同所性注射後、涙腺に隣接して新しい涙小葉が形成された。小葉の大部分はAQP5を高発現する成熟腺房細胞で構成され、AQP5発現の低い小葉内管形成があった。
Rosa涙腺幹細胞注射側の涙液分泌量は対照側よりも高かったが、野生型マウスよりも低かったマトリックスゲルおよびその関連混合物は、使用前に常に氷上に保持しなければならず、マトリックスゲルと接触する微小遠心チューブおよび先端を予冷する必要がある。このシステムは、涙腺幹細胞、涙腺修復、および涙腺疾患の薬物スクリーニングのさらなる研究に理想的なモデルを提供します。
