成年小鼠泪液和下颌腺肌上皮细胞的分离

该协议是重要的，因为它允许分离和隔离两个光滑的肌肉细胞系，肌皮细胞和心状体。此方法通过细胞表面标记结合平滑肌肉细胞的遗传标记，以净化肌皮细胞和心状细胞的种群。该协议允许比较健康和患病的脑皮细胞的功能和再生能力，并处理这些细胞的基因表达研究。

乳腺细胞存在于其他外分泌腺体中，如乳腺、唾液和胰腺，这使得通过分离任何其他组织的脑皮细胞和周利特来适应此协议。要标记α平滑肌肉行为素或SMA表达细胞，注射三至四周大的塔莫西芬-可吸收阿尔法SMA驱动记者小鼠与100微升的塔莫西芬每20克体重内，每天两天一次。对于乳腺收集，在上次注射后两到三天，使用钳子轻轻拉一个腺体，同时用一把小剪刀的尖尖抓划腺周围的结缔组织，以释放腺体。

当乳腺和表层腺分离后，用剪刀将乳腺切出，将腺体放入35毫米的盘中，冰上有两毫升冷PBS。将盘子放在解剖显微镜下，修剪周围的脂肪和结缔组织。然后用两个钳子取出乳腺胶囊。

当所有腺体都收获后，在荧光显微镜下检查一小块组织以确认细胞标记。要准备单细胞悬浮液，请将所有乳腺转移到含有0.5毫升室温消化介质的35毫米培养皿中，然后用小剪刀将腺体切成0.2至1微米方片。使用宽孔移液器滤液尖将切碎的组织转移到两毫升的圆底管中，并将管中的体积与消化介质一起带到两毫升。

反转管子混合，将管子放入37摄氏度的摇培养箱中，每分钟旋转100至120次，90分钟。每30分钟使用1000微升滤波尖缓慢地三角腺片，孔尺寸递减。每次三角化结束时，在显微镜下检查 10 微升等分，以检查聚类。

90分钟后，通过胰岛素注射器针将样品经过2至3次，进一步释放细胞，将细胞溶液转移到15毫升管中。将阻塞介质类型 1 添加到总共五毫升，通过反转混合管子两到三次。通过70微米细胞滤株将细胞进入50毫升管中，用1毫升的阻尼介质1洗涤滤株，然后通过过滤器将细胞滤株一次。

接下来通过离心收集细胞，并在两毫升的阻阻介质类型2中重新暂停颗粒。将细胞转移到两毫升微离心管中，通过离心收集细胞。将细胞重新在一毫升的Acutase溶液中，在37摄氏度和每分钟100至120次旋转下孵育2至3分钟。

在孵育结束时，将细胞转移到50毫升的管中，并加入10毫升的阻尼介质1型。离心后，将细胞重新在六毫升的恢复介质中，在室温下孵育30分钟。在孵育结束时，在显微镜下检查10微升样品，以确保完全分离细胞。

计数后，通过离心收集细胞。要染色荧光激活细胞分选（FACS）的细胞，每两毫升管中含有5倍至5个细胞，其中含有400微升的FACS缓冲液，并加入5微升的亮紫光421抗小鼠CD326和0.5微升的幽灵红780活性染料。彻底混合后，用铝箔包裹管子，在4摄氏度的旋转下孵育45分钟。

在孵育结束时，通过离心收集细胞，并每样本将颗粒重新塞在一毫升的 FACS 缓冲液中。将细胞样本转移到冰上单个五毫升 FACS 管，并使用单色控制调整补偿。然后通过100微米喷嘴以每平方英寸20磅的速度对细胞进行排序。

微血管性膜在毛细血管壁周围发育，并表现出方形。脑皮细胞环绕的颅内分泌物，具有较长的过程，并占据相对较大的区域。在这里，细胞脱离乳腺，准备荧光激活细胞排序，正如刚刚证明的，显示。

对于流动细胞对脑细胞和环皮细胞的分类，细胞应首先被其向前和侧散射区域封闭，然后再排除任何双精度。在浇注以排除死细胞之后，控制样本用于确定背景噪声，并建立适当补偿，以实现信号之间的最佳分离。请记住保持协议中描述的腺体和消化介质体积的数量，并检查组织消化在所有步骤的效率。

分离的细胞可用于多个下游应用，包括体内/体外实验，例如细胞培养、移植、代谢组学、蛋白质组学和单细胞分析。