Este protocolo fornece uma estratégia vantajosa para enriquecer células-tronco da glândula lacrimal para a regeneração e reconstrução da glândula lacrimal. As células-tronco da glândula lacrimal mostram a capacidade de expansão a longo prazo e o potencial de diferenciação. A principal vantagem dessa técnica é que o meio de cultura para células-tronco da glândula lacrimal é livre de soro, o que mostra o enorme valor para o reparo da glândula lacrimal Comece obtendo um rato macho BALB/c de seis a oito semanas de idade e cortando a pele atrás da orelha para expor a glândula lacrimal e o tecido conjuntivo ao seu redor.
Retire o tecido conjuntivo por dissecção contundente com a ajuda de pinças e remova a glândula lacrimal. Mergulhe as glândulas lacrimais em um prato de seis centímetros com quatro mililitros de 75% de etanol por 10 segundos e enxágue imediatamente com solução PBS de 10 milimões duas vezes. Corte as glândulas lacrimais em pequenos fragmentos de cerca de um milímetro cúbico.
Transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e trate os tecidos com 500 microliters de 25 unidades por mililitro despase e 500 microlitres de 0,1% colagenase I por uma hora a 37 graus Celsius. Trate os fragmentos de glândula lacrimal com um mililitro de 0,05% de trippsina EDTA por 10 minutos a 37 graus Celsius e dissociar os fragmentos em células únicas por pipetar repetidamente. Filtre a suspensão através de um filtro de 70 micrômetros, colete o filtro em um tubo de centrífuga de 15 mililitros estéril e centrífuga a 150 vezes G durante cinco minutos.
Após a centrifugação, remova o supernasce, adicione 10 mililitros de solução PBS de 10 mililitros para lavar a pelota celular e centrifute a suspensão a 150 vezes G por cinco minutos. Repita a lavagem da pelota da célula. Em seguida, remova o supernasce e adicione um mililitro de uma proporção de 1:1 do Medium de Águias Modificadas de Dulbecco e f-12 de Ham para resuspencar as pelotas de célula.
Adicione 20 microliters de matriz gel lacrimal matriz matriz de células-tronco no centro do poço de uma placa de 24 poços. Use uma ponta de pipeta para expandi-la para um círculo de cerca de seis a oito milímetros de diâmetro e incubar a mistura por 20 minutos a 37 graus Celsius para pré-revestir o poço. Use um contador celular para determinar o número de células e adicione 40 microliters de meio de células-tronco da glândula lacrimal, ou LGSCM, com um total de 10.000 células em 40 microlitres do gel de matriz.
Misture-os suavemente com uma pipeta. Use uma pipeta para soltar cuidadosamente 80 microliters da mistura sobre a área pré-revestida em cada poço da placa de 24 poços. Incubar a mistura por 20 minutos a 37 graus Celsius e adicionar 600 microliters de LGSCM.
Mude o meio de cultura em cada poço uma vez a cada dois dias. Após sete dias de cultura, procure por esferas LGSC de 100 a 300 micrômetros de diâmetro sob o microscópio invertido. Use este protocolo para isolar e cultivar células-tronco primárias da glândula lacrimal de camundongos Rosa26 e NOD.
Após sete dias de cultura, remova bem o meio cultural da cultura da esfera. Desagregar as esferas LGSC por incubação em 20 microlitres de 10 unidades por mililitro despase e 100 microlitres de PBS de 10 mililitros por 30 minutos a 37 graus Celsius. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 150 vezes G por quatro minutos.
Remova o supernatante. Trate as esferas com um mililitro de 0,05% trypsin EDTA por cinco minutos a 37 graus Celsius Adicione um mililitro de 0,05% inibidor de trippsina e pipeta repetidamente para neutralizar a trippsina e dissociar as esferas em células únicas. Centrifugar a 150 vezes G por cinco minutos e remover o supernatante para pelotar os LGSCs.
Adicione um mililitro de LGSCM para resuspensar a pelota de células-tronco da glândula lacrimal e emplacar as células como demonstrado anteriormente. Se realizar o procedimento um, amplie o tempo de cultura dos LGSCs de sete para 14 dias com o sistema de cultura de células-tronco da glândula lacrimal para diferenciação aleatória. Para o procedimento dois, altere a proporção do gel de matriz para LGSCM de 1:1 para 1:2 no início da cultura das células-tronco da glândula lacrimal para a diferenciação das células ductais.
Semente as células-tronco da glândula lacrimal na matriz para indução por 14 dias. Para o procedimento três, após passagem, substitua o LGSCM por LGSCM 10% FBS pela diferenciação das células acinar. Induzir diferenciação por 14 dias.
Após uma semana de cultura, Kr14 e Ki67 foram expressos em todas as esferas formadas por células-tronco da glândula lacrimal. As esferas atingiram um diâmetro de 100 micrômetros. A hematoxilina e a coloração de eosina mostraram a celularidade no sétimo dia.
Os fatores de enriquecimento das células-tronco da glândula lacrimal obtidos após sete dias de cultura primária e subcultura indicaram que as células enriquecidas por esse método tinham forte capacidade de proliferação. Neste sistema, as células-tronco da glândula lacrimal poderiam ser ultrapassadas mais de 40 vezes e ainda manter características de células-tronco. As células-tronco da glândula lacrimal foram induzidas a formar mais brotos pelo soro bovino fetal e uma baixa proporção de gel matricial.
A hematoxilina e a coloração de eosina indicaram que o soro bovino fetal poderia induzir as esferas a produzir mais estruturas cavitadoras. Após a injeção ortotópica de células-tronco da glândula lacrimal Rosa em camundongos NOD, novos lobos lacrimais foram formados adjacentes às glândulas lacrimais. A maioria dos lobules eram compostos de células acinar maduras com alta expressão de AQP5 e houve formação de duto intralobular com baixa expressão AQP5.
A quantidade de secreção lacrimal no lado de injeção de células-tronco da glândula lacrimal Rosa foi maior do que no lado de controle, mas menor do que nos ratos do tipo selvagem O gel de matriz e sua mistura relacionada devem ser sempre mantidos no gelo antes do uso e o tubo de microcentrifusagem e as pontas em contato com o gel devem ser pré-resfriados. O sistema fornece um modelo ideal para um estudo mais aprofundado das células-tronco da glândula lacrimal, reparação da glândula lacrimal e triagem de medicamentos para doenças da glândula lacrimal.
