我们正在引入一种在培养板中建立人类气道上皮的类器官培养的方法。我们直接从初级肺组织中高效衍生出人肺类器官。衍生的人肺类器官稳定扩张超过一年，近端分化方案允许产生成熟的气道类器官，可以忠实地模拟人气道上皮到接近生理水平。
因此，培养系统允许科学家重建和扩展培养板中的人类气道上皮。演示该程序的将是我们实验室的Man Chun Chiu和Yifei Yu博士生开始从人体肺组织中分离细胞以进行3D类器官培养，用无菌手术刀将肺组织切成一毫米的小块，并用10毫升冷基底培养基洗涤组织块。在4摄氏度下以400倍G离心组织五分钟，弃去上清液，然后将沉淀重悬于八毫升补充胶原酶的基础培养基中，最终浓度为每毫升两毫克。
然后，通过在37摄氏度下以120 RPM摇动管子30至40分钟来消化组织碎片。消化后，使用10毫升血清学移液器上下移液20次，以剪切消化的组织碎片。然后，用100微米过滤器将悬浮液过滤到50毫升管中。
回收组织片并将其从过滤器转移到带有基础介质的15毫升离心管中。为了终止消化，将胎牛血清加入到流出的终浓度为2%，然后，离心管并将细胞沉淀重悬于10毫升的基础培养基中，如前所述。离心后，将沉淀重悬于80至160微升的冷基底基质介质中，并将管置于冰上。
接下来，将40微升悬浮液分配到预热的24孔悬浮培养板的每个孔中。将板在37摄氏度孵育10至15分钟。让基底基质凝固并形成液滴。
孵育后，向每个孔中加入500微升补充有五纳摩尔的heregulin-β-1的人肺类器官扩增培养基，并将板在细胞培养箱中孵育。三天后，取出旧培养基，同时保持液滴完好无损，并小心地加入新鲜培养基。经过10至14天的传代后，在显微镜下观察类器官，并确保类器官未嵌入非常高的细胞密度。
要通过剪切通过肺类器官，请通过用一毫升尖端上下移液来打破液滴。然后，将类器官与培养基一起转移到15毫升离心管中，并用冷的基础介质将体积调节至10毫升。在4摄氏度下以300倍G离心管5分钟，弃去上清液，用10毫升冷基础培养基洗涤类器官。
然后，将类器官重悬于两毫升冷基础培养基中，并用巴斯德移液管剪切成小块。接下来，将基础培养基加入到10毫升的总体积中并离心，然后用足够1：3至1：5的冷基底基质重悬类器官碎片，并将管置于冰上。在预热的24孔板的每个孔中分配40微升类器官悬浮液，在37摄氏度下孵育，以使基底基质固化10至15分钟。
之后，向每个孔中加入500微升肺类器官扩增培养基，并在细胞培养箱中孵育。每三天刷新一次培养基，每两周通过一次类器官。为了通过胰蛋白酶消化通过肺类器官，将收获的肺类器官重悬于一毫升解离酶中。
将类器官在37摄氏度的水浴中孵育三到五分钟。然后，向管中加入一毫升基础培养基，并通过上下移液机械剪切类器官。在显微镜下以100X放大倍率检查类器官碎片的大小，然后用40微升胎牛血清终止消化。
用基础培养基和离心机将体积组成10毫升，然后将类器官碎片重悬于冷基底基质中，其体积足以以1：5至1：10的比例通过。之后，在24孔板的每个孔中分配40微升类器官悬浮液，并如前所述培养该板。为了产生3D气道类器官，在通过机械剪切传代后，将肺类器官在膨胀培养基中孵育7至10天。
然后，用近端分化培养基替换扩增培养基，并将类器官在细胞培养箱中孵育。14天后，丢弃每个孔中的培养基并加入细胞裂解物缓冲液以收获分化的气道类器官，用于RNA提取和通过RT-qPCR测定检测细胞基因表达。将插入片段在细胞培养箱中分别用250和500微升的基础培养基在24孔板的顶部和底部室中预孵育。
然后，向管中加入一毫升基础培养基，上下移液，将类器官剪切成单个细胞。在显微镜下观察细胞，然后用40微升胎牛血清终止消化。将细胞通过40微米过滤器过滤到50毫升管中，并将过滤后的细胞悬浮液转移到15毫升管中。
用基础介质将悬浮液加满至总体积为10毫升。离心后，根据细胞密度，重悬于从1至2.5毫升肺类器官扩增培养基中的24个液滴中收集的沉淀。在显微镜下用细胞计数器计数细胞数量，然后将细胞浓度调节至1.3倍，10至每毫升6个，用于24孔插入物。
从顶部和底部腔室中取出基础介质，然后在底部腔室中加入500微升膨胀介质。将先前制备的100微升细胞悬浮液种子到24孔插入物的顶端室中并孵育。两天后，在板的顶腔和底室中用近端分化介质替换膨胀介质。
将类器官孵育14天，每三天刷新一次培养基。每天使用电阻测量系统测量经上皮电阻。在具有代表性的显微照片中，可以看到新分离的肺细胞嵌入到生长因子降低的基底膜基质中二型。
囊性类器官随着时间的推移而出现和生长。这里演示了第四次通过后的肺类器官。在机械剪切的两小时内，嵌入基底膜提取物中的类器官碎片形成囊性结构域。
第五天同一场的显微照片证实了类器官随时间的生长。扩张的类器官囊括了四种主要的气道上皮细胞类型，包括ACCTUB阳性或FOXJ1阳性纤毛细胞，P63阳性基底细胞，CC10阳性俱乐部细胞和MUC5AC阳性杯细胞处于过早状态。随着时间的推移，在扩增和近端分化培养基中孵育的类器官发展出独特的形态。
在近端分化培养基中分化两周后，在每个类器官中都可辨别出运动纤毛。观察到同步跳动的西莉亚驱动类器官腔内的细胞碎片，并单向旋转它们以除去吸入的颗粒。此外，流式细胞术分析表明，分化的类器官在近端分化和扩增培养基中容纳了四种气道上皮细胞类型。
分化两周后，2D 气道类器官形成完整的上皮屏障。进行葡聚糖阻塞测定以评估在2D气道类器官中形成的上皮屏障的完整性。2D类器官含有丰富的纤毛细胞。
长期可扩张的肺类器官和分化的气道类器官为研究呼吸生物学和病理学（包括COVID-19）提供了生理上活跃和通用的模型系统。
