从小鼠子宫建立3D子宫内膜类器官

该协议意义重大，因为它显示了从小鼠子宫中分离高纯度子宫上皮以进行子宫内膜类器官培养的分步方法。该方法有效地利用酶和机械解离来分离子宫上皮。这些技术被简化为建立、治疗和分析源自分离上皮的子宫内膜上皮类器官。

使用前首先在冰上解冻凝胶基质约一到两个小时。然后解剖安乐死的小鼠，用剪刀在腹部做一个中线切口，轻轻剥开皮肤，露出下面的腹膜层。通过将腹部脂肪垫轻轻移到一边来定位子宫角，并将子宫角保持在宫颈交界处，然后沿着肠系膜脂肪切割它们。

解剖小鼠子宫后，用小剪刀彻底去除子宫角上的脂肪组织。完成后，将每个子宫角切成小碎片，每个碎片的尺寸约为四到五毫米。将来自一个子宫的所有子宫碎片放入含有0.5毫升1%胰蛋白酶的24孔板的一个孔中。

然后将 24 孔板在 37 摄氏度的加湿组织培养箱中孵育约 1 小时，以酶促分离子宫内膜上皮与底层基质。孵育后，将子宫碎片转移到含有一毫升Dulbecco磷酸盐缓冲溶液或DPBS的35毫米组织培养板中。接下来，在解剖显微镜下将子宫上皮与子宫管分离，方法是用镊子握住子宫碎片的一端，轻轻地将移液器尖端纵向穿过碎片，将上皮挤出子宫管的另一端。

然后在解剖显微镜下观察从子宫碎片分离的上皮片。接下来，使用一毫升移液管轻轻地将所有上皮片转移到同一个 1.5 毫升管中。并通过以375×g离心五分钟来沉淀解离的上皮片。

小心地除去上清液而不干扰细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于0.5毫升2.5毫克/毫升胶原酶加上每毫升2毫克DNA溶液中。上下移液约10次或直到达到单细胞悬液。接下来，加入 0.5 毫升 DMEM F/12 加 10% 胎牛血清或 FBS 加抗生素，并以 375 x g 离心细胞五分钟。

除去上清液，将细胞重悬于一毫升DMEM / F12加10%FBS加抗生素中，然后离心细胞。将凝胶基质放在冰上，直到准备好。接下来，从离心细胞中取出上清液，并使用20倍于凝胶基质体积的细胞沉淀重悬细胞沉淀，而不引入气泡。

让凝胶基质细胞悬液在室温下沉降约10分钟。一旦凝胶基质细胞悬液变成半固体凝胶，使用宽孔200微升尖端的P200微量移液器，轻轻吸出25微升凝胶基质细胞悬液。在 12 孔板的每个孔中分配三个独立的 25 微升圆顶，让凝胶基质固化 15 分钟和 37 摄氏度加湿组织培养箱。

凝胶基质固化后，向每个含有凝胶基质圆顶的孔中加入750微升类器官培养基，并在37摄氏度的加湿组织培养箱中培养箱。小鼠子宫内膜类器官的相差图像显示，上皮和基质细胞分离产生的样品对相反细胞类型的污染不超过10%至15%。子宫内膜上皮细胞在三到四天内组装成类器官。

切片的福尔马林固定石蜡包埋子宫内膜类器官通过苏木精和伊红染色剂可视化，其显示单层上皮和空心中心，即类器官的管腔。荧光显微镜成像显示，类器官中的所有细胞均为细胞角蛋白8阳性，并含有DAPI，表明子宫内膜类器官的固定、包埋和处理与基于抗体的免疫染色相容。实时定量PCR显示，10 nmol雌二醇刺激增加了上皮类器官中脂质运载蛋白2、乳铁蛋白和孕酮受体的表达，表明子宫内膜上皮类器官可以成功用于测量雌二醇响应的基因表达变化。

重要的是要确保在机械解离步骤中获得子宫内膜上皮的清晰分离。人们应该能够观察到从子宫管中出现的上皮。其他方法包括通过封装到凝胶基质中来建立上皮类器官。

如果需要，可以进一步消化基质区室以创建3D上皮基质共培养物。该方法可以帮助回答有关控制子宫内膜更新的信号的问题。它可以帮助治疗女性的疾病，如子宫内膜异位症、妊娠丢失和癌症。