使用多种荧光染色和组织清除方法以3D模式展示毛茸茸和光滑的皮肤神经支配

该方案提供了一种使用共聚焦显微镜观察同步部分的可行方法，可以确保神经纤维观察的精度。简单易用的组织清洁方案是这种技术的主要优点。组织清洁过程非常高效，大约需要30分钟到一个小时。

如文本手稿中所述，对安乐死的大鼠进行灌注。使用手术刀从后爪上取下背部和鞋底的皮肤。对于需要冷冻切片的样品，将组织从4%的醛中固定在0.1摩尔PB中两小时。

洗涤后，将皮肤组织嵌入37摄氏度的2%琼脂糖中，并将其放入冰盒中冷却。用冰水将安装的组织固定在振动微调上，并在横向方向上以500微米的厚度将其切片。切片后，从切片中取出琼脂糖并将其储存在具有1x PBS的六孔板中。

将组织切片在2%曲肽X-100的溶液中在1x PBS中以4摄氏度孵育过夜。将组织切片放入封闭缓冲液中，并在振荡器上以每分钟72次旋转，在四摄氏度下旋转过夜。将组织切片转移到含有小鼠单克隆抗CGRP和绵羊多克隆抗LYVE-1抗体的一抗的溶液中，在微量离心管中的稀释缓冲液中。

然后在摇床上以四摄氏度旋转两天。在室温下用洗涤缓冲液洗涤组织切片两次，然后在洗涤缓冲液中以四摄氏度将其保持在振荡器上过夜。第二天，将组织切片转移到微量离心管中含有二抗的混合溶液中，并在振荡器上以每分钟72转的速度在四摄氏度下旋转五小时。

在室温下用洗涤缓冲液在六孔板中洗涤组织切片两次，持续一小时。将组织切片保持在振荡器上的洗涤缓冲液中，在四摄氏度下过夜。将组织切片转移到组织清除试剂中，并在室温下在振荡器上以每分钟60转的速度轻轻旋转一小时。

将透明组织安装在载玻片上，然后用垫片圈住组织，并用新鲜的组织清除试剂和盖玻片粘住间隙。3D模式表明CGRP阳性神经纤维通过皮下组织和真皮到达表皮。这些神经纤维在皮下组织中成束运行，在真皮内分支并终止于表皮。

相反，阳性血管中的鬼臼蛋白和LYVE-1阳性淋巴管分布在皮下组织和真皮中。通常，CGRP阳性神经纤维平行或包围血管和淋巴管，在毛茸茸和光滑的皮肤中形成3D网络。使用常规方法，虽然神经纤维血管和淋巴管在薄片中用CGRP鬼笔环蛋白和LYVE-1清楚地标记，但这些结构的观察受到切片厚度的限制，无法完全观察到。

在厚度为30 μm的切片中，CGRP阳性神经纤维表面积的毛茸茸的皮肤和光滑的皮肤之间没有差异。在300微米厚的组织切片中，与毛茸茸的皮肤相比，松弛皮肤CGRP正神经纤维的表面积显著增加。在抗体孵育后使用具有高渗透压的清洁缓冲液非常重要。

几次，免疫荧光染色所需的清洁时间是必要的。按照这个程序，我们认为有可能染色和观察其他组织和器官的六个部分也存在。这种技术可以帮助神经科学研究人员了解神经纤维的表面积和状态。

它还有助于我们观察组织和器官的创新。