Notre protocole a fourni une méthode réalisable pour observer la section de synchronisation à l’aide d’un microscope confocal, ce qui pourrait assurer la précision dans l’observation des fibres nerveuses. Un protocole de nettoyage des tissus simple et facile est l’un des principaux avantages de cette technique. Le processus de nettoyage des tissus est efficace et prend environ 30 minutes à une heure.
Effectuer une perfusion sur le rat euthanasié comme mentionné dans le manuscrit du texte. Utilisez un scalpel pour enlever la peau du dos et la plante de la patte postérieure. Pour les échantillons nécessitant une section congelée, fixez les tissus dans 4% d’aldéhyde dans 0,1 molaire PB pendant deux heures.
Après le lavage, incorporez les tissus cutanés dans de l’agarose à 2% à 37 degrés Celsius et placez-les à l’intérieur de la glacière pour le refroidissement. Fixez le tissu monté sur le microton vibratoire avec de l’eau glacée et coupez-les à une épaisseur de 500 micromètres dans la direction transversale. Après le tranchage, retirez l’agarose des sections et stockez-les dans une plaque à six puits avec 1x PBS.
Incuber les coupes tissulaires dans une solution de 2% de triton X-100 dans 1x PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Placez les sections de tissu dans le tampon bloquant et faites pivoter à 72 rotations par minute sur le shaker pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Transférer les coupes de tissu dans la solution contenant les anticorps primaires de l’anti-CGRP monoclonal de souris et de l’anticorps polyclonal anti-LYVE-1 de mouton dans un tampon de dilution dans le tube de microcentrifugation.
Ensuite, faites pivoter le shaker pendant deux jours à quatre degrés Celsius. Lavez les coupes de tissu deux fois avec un tampon de lavage à température ambiante, puis conservez-les sur le shaker pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans le tampon de lavage. Le lendemain, transférer les coupes de tissu dans la solution mélangée contenant les anticorps secondaires dans un tube de microcentrifugation et tourner à 72 rotations par minute sur le shaker pendant cinq heures à quatre degrés Celsius.
Lavez les sections de tissu dans une plaque de six puits avec tampon de lavage deux fois pendant une heure à température ambiante. Gardez les sections de tissu dans un tampon de lavage sur le shaker pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Transférer les sections de tissu dans le réactif de nettoyage des tissus et tourner à 60 rotations par minute sur le shaker doucement pendant une heure à température ambiante.
Montez les tissus transparents sur la glissière, puis encerclez les tissus avec une entretoise et collez l’espace avec un réactif de nettoyage des tissus frais et un glissement de couverture. Le motif 3D a démontré que les fibres nerveuses CGRP positives passaient à travers le tissu sous-cutané et le derme jusqu’à l’épiderme. Ces fibres nerveuses couraient en faisceaux dans le tissu sous-cutané ramifié dans le derme et se terminaient dans l’épiderme.
En revanche, la phalloïdine dans les vaisseaux sanguins positifs et les vaisseaux lymphatiques LYVE-1 positifs sont distribués dans le tissu sous-cutané et le derme. Généralement, les fibres nerveuses CGRP positives étaient parallèles ou entouraient les vaisseaux sanguins et lymphatiques formant un réseau 3D dans la peau poilue et glabre. Avec l’approche conventionnelle, bien que les fibres nerveuses des vaisseaux sanguins et lymphatiques aient été clairement marqués avec CGRP phalloidin et LYVE-1 dans les sections minces, l’observation de ces structures était limitée par l’épaisseur de la tranche et ne peut pas être observée complètement.
Dans la section d’une épaisseur de 30 micromètres, il n’y avait aucune différence entre la peau poilue et la peau glabre dans la surface des fibres nerveuses CGRP positives. Dans les sections de tissus de 300 micromètres d’épaisseur, par rapport à la peau poilue, la surface des fibres nerveuses CGRP positives de la peau glabre a été significativement augmentée. Il est important d’utiliser le tampon de nettoyage avec une pression osmotique élevée après l’incubation des anticorps.
Plusieurs fois, le temps de nettoyage requis pour la coloration immunofluorescence est nécessaire. Suite à cette procédure, nous pensons qu’il existe également une possibilité de coloration et d’observation d’autres tissus et organes dans six sections. Cette technique pourrait aider les chercheurs en neurosciences à rencontrer la surface et l’état des fibres neurologiques.
Il nous aide également à observer l’innovation des tissus et des organes.
