Unser Protokoll bot eine praktikable Methode, um den Sync-Abschnitt mit einem konfokalen Mikroskop zu beobachten, was eine Präzision bei der Beobachtung der Nervenfasern gewährleisten konnte. Ein einfaches und leichtes Tissue-Reinigungsprotokoll ist ein Hauptvorteil dieser Technik. Der Tissue-Reinigungsprozess ist effizient und dauert etwa 30 Minuten bis zu einer Stunde.
Führen Sie eine Perfusion an der eingeschläferten Ratte durch, wie im Textmanuskript erwähnt. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut des Rückens und der Sohle von der Hinterpfote zu entfernen. Für Proben, die einen gefrorenen Abschnitt erfordern, fixieren Sie das Gewebe in 4% aus Aldehyd in 0,1 molaren PB für zwei Stunden.
Nach dem Waschen betten Sie die Hauttücher bei 37 Grad Celsius in 2% Agarose ein und legen Sie sie zur Kühlung in die Eisbox. Fixieren Sie das montierte Gewebe mit Eiswasser auf dem Vibrationsmikroton und schneiden Sie es mit einer Dicke von 500 Mikrometern in Querrichtung auf. Entfernen Sie nach dem Schneiden die Agarose aus den Abschnitten und lagern Sie sie in einer Sechs-Well-Platte mit 1x PBS.
Inkubieren Sie die Gewebeabschnitte in einer Lösung von 2% Triton X-100 in 1x PBS über Nacht bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Gewebeabschnitte in den Sperrpuffer und drehen Sie sie mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Die Gewebeabschnitte werden in die Lösung mit den primären Antikörpern des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers der Maus und des polyklonalen Anti-LYVE-1-Antikörpers der Schafe im Verdünnungspuffer im Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Dann zwei Tage bei vier Grad Celsius auf dem Shaker drehen. Waschen Sie die Gewebepartien zweimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur und halten Sie sie dann über Nacht bei vier Grad Celsius im Waschpuffer auf dem Shaker. Am nächsten Tag die Gewebeabschnitte in die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern in einem Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker fünf Stunden lang bei vier Grad Celsius rotieren.
Waschen Sie die Gewebeabschnitte in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit Waschpuffer zweimal für eine Stunde bei Raumtemperatur. Halten Sie die Gewebeabschnitte im Waschpuffer auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Gewebeabschnitte in das Gewebereinigungsreagenz und drehen Sie sich mit 60 Umdrehungen pro Minute sanft für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Montieren Sie das klare Gewebe auf dem Objektträger, umkreisen Sie dann das Gewebe mit einem Abstandshalter und kleben Sie den Spalt mit frischem Gewebereinigungsreagenz und Deckschlitten. Das 3D-Muster zeigte, dass die CGRP-positiven Nervenfasern durch das Unterhautgewebe und die Dermis zur Epidermis gelangten. Diese Nervenfasern verliefen in Bündeln im Unterhautgewebe, die innerhalb der Dermis verzweigt und in der Epidermis abgeschlossen waren.
Im Gegensatz dazu sind Phalloidin in positiven Blutgefäßen und LYVE-1-positive Lymphgefäße im Unterhautgewebe und in der Dermis verteilt. Im Allgemeinen verliefen die CGRP-positiven Nervenfasern parallel zu den Blutgefäßen und Lymphgefäßen und umgaben sie und bildeten ein 3D-Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Beim konventionellen Ansatz waren zwar die Nervenfasern Blutgefäße und Lymphgefäße in den dünnen Abschnitten eindeutig mit CGRP-Phalloidin und LYVE-1 markiert, die Beobachtung dieser Strukturen war jedoch durch die Schichtdicke begrenzt und kann nicht vollständig beobachtet werden.
In dem Abschnitt mit einer Dicke von 30 Mikrometern gab es keinen Unterschied zwischen behaarter Haut und kahler Haut in der Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern. In den 300 Mikrometern dicken Gewebeabschnitten wurde im Vergleich zu behaarter Haut die Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern der kahlen Haut signifikant vergrößert. Es ist wichtig, den Reinigungspuffer mit hohem osmotischem Druck nach der Antikörperinkubation zu verwenden.
Mehrmals ist die Reinigungszeit notwendig, die für die Immunfluoreszenzfärbung benötigt wird. Nach diesem Verfahren glauben wir, dass es auch eine Möglichkeit der Färbung und Beobachtung anderer Gewebe und Organe in sechs Abschnitten gibt. Diese Technik könnte neurowissenschaftlichen Forschern helfen, auf die Oberfläche und den Zustand von Neurofasern zu stoßen.
Es hilft uns auch, die Innovation von Geweben und Organen zu beobachten.
