Nuestro protocolo proporcionó un método factible para observar la sección de sincronización utilizando un microscopio confocal, que podría garantizar la precisión en la observación de las fibras nerviosas. El protocolo de limpieza de tejidos simple y fácil es una de las principales ventajas de esta técnica. El proceso de limpieza de tejidos es eficiente y toma alrededor de 30 minutos a una hora.
Realizar perfusión en la rata sacrificada como se menciona en el manuscrito del texto. Use un bisturí para eliminar la piel del dorso y la suela de la pata trasera. Para las muestras que requieren una sección congelada, fije los tejidos en un 4% de aldehído en PB molar 0.1 durante dos horas.
Después del lavado, incruste los tejidos de la piel en agarosa al 2% a 37 grados centígrados y colóquelos dentro de la caja de hielo para enfriarlos. Fije el tejido montado en el microtono vibratorio con agua helada y córtelos a un grosor de 500 micrómetros en la dirección transversal. Después de cortar, retire la agarosa de las secciones y guárdelas en una placa de seis pocillos con 1x PBS.
Incubar las secciones de tejido en una solución de 2%tritón X-100 en 1x PBS durante la noche a cuatro grados centígrados. Coloque las secciones de tejido en el tampón de bloqueo y gire a 72 rotaciones por minuto en el agitador durante la noche a cuatro grados centígrados. Transfiera las secciones de tejido a la solución que contiene los anticuerpos primarios del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CGRP y el anticuerpo policlonal anti-LYVE-1 de oveja en tampón de dilución en el tubo de micro centrífuga.
Luego gire sobre la coctelera durante dos días a cuatro grados centígrados. Lave las secciones de tejido dos veces con tampón de lavado a temperatura ambiente, luego manténgalas en el agitador durante la noche a cuatro grados centígrados en el tampón de lavado. Al día siguiente, transfiera las secciones de tejido a la solución mixta que contiene los anticuerpos secundarios en un tubo de micro centrífuga y gire a 72 rotaciones por minuto en el agitador durante cinco horas a cuatro grados centígrados.
Lave las secciones de tejido en una placa de seis pocillos con tampón de lavado dos veces durante una hora a temperatura ambiente. Mantenga las secciones de tejido en el tampón de lavado en el agitador durante la noche a cuatro grados centígrados. Transfiera las secciones de tejido al reactivo de limpieza de tejido y gire a 60 rotaciones por minuto en el agitador suavemente durante una hora a temperatura ambiente.
Monte los tejidos transparentes en el portaobjetos, luego rodee los tejidos con un espaciador y pegue el espacio con un reactivo de limpieza de tejido fresco y un resbalón de cubierta. El patrón 3D demostró que las fibras nerviosas positivas para CGRP pasaron a través del tejido subcutáneo y la dermis hasta la epidermis. Estas fibras nerviosas corrían en haces en el tejido subcutáneo ramificado dentro de la dermis y terminado en la epidermis.
Por el contrario, la faloidina en los vasos sanguíneos positivos y los vasos linfáticos positivos de LYVE-1 se distribuyen en el tejido subcutáneo y la dermis. En general, las fibras nerviosas positivas para CGRP corrían paralelas o rodeaban los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos formando una red 3D en la piel peluda y glabra. Con el enfoque convencional, aunque los vasos sanguíneos de las fibras nerviosas y los vasos linfáticos estaban claramente marcados con faloidina CGRP y LYVE-1 en las secciones delgadas, la observación de estas estructuras estaba limitada por el grosor de la rebanada y no se puede observar por completo.
En la sección con un grosor de 30 micrómetros, no hubo diferencia entre la piel peluda y la piel glabra en el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP. En las secciones de tejido de 300 micrómetros de espesor, en comparación con la piel peluda, el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP de la piel glabra aumentó significativamente. Es importante usar el tampón de limpieza con alta presión osmótica después de la incubación de anticuerpos.
Varias veces, el tiempo de limpieza requerido para la tinción de inmunofluorescencia es necesario. Después de este procedimiento, creemos que existe la posibilidad de tinción y observación de otros tejidos y órganos en seis secciones. Esta técnica podría ayudar a los investigadores de neurociencia a encontrar el área de superficie y el estado de las fibras neuronales.
También nos ayuda a observar la innovación de tejidos y órganos.
