قدم بروتوكولنا طريقة مجدية لمراقبة قسم المزامنة باستخدام المجهر البؤري ، والذي يمكن أن يضمن الدقة في مراقبة الألياف العصبية. بروتوكول تنظيف الأنسجة البسيط والسهل هو الميزة الرئيسية لهذه التقنية. عملية تنظيف الأنسجة فعالة وتستغرق حوالي 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
إجراء التروية على الفئران التي تم قتلها رحيما كما هو مذكور في مخطوطة النص. استخدم مشرطا لإزالة جلد الظهرية والنعل من المخلب الخلفي. بالنسبة للعينات التي تتطلب قسما مجمدا ، قم بإصلاح الأنسجة بنسبة 4٪ من الألدهيد في 0.1 PB مولي لمدة ساعتين.
بعد الغسيل ، قم بتضمين أنسجة الجلد في 2٪ من الأغاروز عند 37 درجة مئوية وضعها داخل صندوق الثلج للتبريد. قم بإصلاح الأنسجة المثبتة على الميكروتون الاهتزازي بالماء المثلج وقم بتقطيعها بسماكة 500 ميكرومتر في الاتجاه المستعرض. بعد التقطيع ، قم بإزالة الأغاروز من الأقسام وتخزينها في لوحة من ستة آبار مع 1x PBS.
احتضان أقسام الأنسجة في محلول 2٪ triton X-100 في 1x PBS بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ضع أقسام الأنسجة في المخزن المؤقت المانع وقم بتدويرها بمعدل 72 دورة في الدقيقة على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. انقل أقسام الأنسجة إلى المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية للأجسام المضادة للفأر أحادي النسيلة المضاد ل CGRP والأغنام متعددة النسيلة المضادة LYVE-1 في مخزن مؤقت للتخفيف في أنبوب الطرد المركزي الصغير.
ثم تدور على الخلاط لمدة يومين عند أربع درجات مئوية. اغسل أقسام المناديل مرتين باستخدام مخزن الغسيل المؤقت في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتفظ بها على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية في مخزن الغسيل. في اليوم التالي ، انقل مقاطع الأنسجة إلى المحلول المختلط الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في أنبوب طرد مركزي صغير وقم بتدويرها بمعدل 72 دورة في الدقيقة على الخلاط لمدة خمس ساعات عند أربع درجات مئوية.
اغسل أقسام الأنسجة في صفيحة من ستة آبار مع مخزن مؤقت للغسيل مرتين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بأقسام الأنسجة في الغسيل العازل على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. انقل مقاطع الأنسجة إلى كاشف إزالة الأنسجة وقم بتدويرها بمعدل 60 دورة في الدقيقة على الخلاط بلطف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
قم بتركيب الأنسجة الشفافة على الشريحة ثم قم بتدوير الأنسجة باستخدام فاصل والتمسك بالفجوة باستخدام كاشف إزالة الأنسجة الطازجة وغطاء الانزلاق. أظهر نمط 3D أن الألياف العصبية الإيجابية CGRP مرت عبر الأنسجة والأدمة تحت الجلد إلى البشرة. ركضت هذه الألياف العصبية في حزم في الأنسجة تحت الجلد المتفرعة داخل الأدمة وانتهت في البشرة.
في المقابل ، يتم توزيع الفيلويدين في الأوعية الدموية الإيجابية والأوعية اللمفاوية الإيجابية LYVE-1 في الأنسجة تحت الجلد والأدمة. بشكل عام ، ركضت الألياف العصبية الإيجابية CGRP بالتوازي مع أو تحيط بالأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية التي تشكل شبكة 3D في الجلد المشعر والزجاجي. مع النهج التقليدي ، على الرغم من أن الأوعية الدموية للألياف العصبية والأوعية اللمفاوية كانت موسومة بوضوح ب CGRP phalloidin و LYVE-1 في الأقسام الرقيقة ، إلا أن مراقبة هذه الهياكل كانت محدودة بسمك الشريحة ولا يمكن ملاحظتها تماما.
في القسم الذي يبلغ سمكه 30 ميكرومتر ، لم يكن هناك فرق بين الجلد المشعر والجلد اللامع في مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP. في أقسام الأنسجة السميكة التي يبلغ سمكها 300 ميكرومتر ، مقارنة بالجلد المشعر ، زادت مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP للجلد الزجاجي بشكل كبير. من المهم استخدام مخزن التنظيف العازل ذو الضغط الأسموزي العالي بعد حضانة الأجسام المضادة.
عدة مرات ، من الضروري تحديد وقت التنظيف اللازم لتلطيخ التألق المناعي. بعد هذا الإجراء ، نعتقد أن هناك إمكانية لتلطيخ ومراقبة الأنسجة والأعضاء الأخرى في ستة أقسام موجودة أيضا. يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين في علم الأعصاب على مواجهة مساحة السطح وحالة الألياف العصبية.
كما أنه يساعدنا على مراقبة ابتكار الأنسجة والأعضاء.
