Il nostro protocollo ha fornito un metodo fattibile per osservare la sezione di sincronizzazione utilizzando il microscopio confocale, che potrebbe garantire precisione nell'osservazione delle fibre nervose. Il protocollo di pulizia dei tessuti semplice e facile è uno dei principali vantaggi di questa tecnica. Il processo di pulizia dei tessuti è efficiente e richiede da circa 30 minuti a un'ora.
Condurre la perfusione sul ratto eutanasizzato come menzionato nel manoscritto del testo. Utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle del dorso e la suola dalla zampa posteriore. Per i campioni che richiedono una sezione congelata, post fissare i tessuti in 4% da aldeide in 0,1 PB molare per due ore.
Dopo il lavaggio, incorporare i tessuti della pelle in 2% di agarosio a 37 gradi Celsius e posizionarli all'interno della ghiacciaia per il raffreddamento. Fissare il tessuto montato sul microtono vibrante con acqua ghiacciata e affettarli ad uno spessore di 500 micrometri in direzione trasversale. Dopo l'affettamento, rimuovere l'agarosio dalle sezioni e conservarle in una piastra a sei pozzetti con 1x PBS.
Incubare le sezioni di tessuto in una soluzione di 2% tritone X-100 in 1x PBS durante la notte a quattro gradi Celsius. Posizionare le sezioni di tessuto nel tampone di blocco e ruotare a 72 rotazioni al minuto sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire le sezioni tissutali nella soluzione contenente gli anticorpi primari dell'anticorpo monoclonale di topo anti-CGRP e dell'anticorpo policlonale anti-LYVE-1 di pecora nel tampone di diluizione nel tubo della micro centrifuga.
Quindi ruotare sullo shaker per due giorni a quattro gradi Celsius. Lavare le sezioni di tessuto due volte con tampone di lavaggio a temperatura ambiente, quindi tenerle sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius nel tampone di lavaggio. Il giorno successivo, trasferire le sezioni di tessuto nella soluzione mista contenente gli anticorpi secondari in un tubo di micro centrifuga e ruotare a 72 rotazioni al minuto sullo shaker per cinque ore a quattro gradi Celsius.
Lavare le sezioni di tessuto in una piastra a sei pozzetti con tampone di lavaggio due volte per un'ora a temperatura ambiente. Mantenere le sezioni di tessuto nel tampone di lavaggio sullo shaker durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire le sezioni di tessuto nel reagente di compensazione dei tessuti e ruotare delicatamente a 60 rotazioni al minuto sullo shaker per un'ora a temperatura ambiente.
Montare i tessuti trasparenti sul vetrino, quindi circondare i tessuti con un distanziatore e incollare lo spazio con il reagente di pulizia del tessuto fresco e coprire lo scivolamento. Il modello 3D ha dimostrato che le fibre nervose positive CGRP passavano attraverso il tessuto sottocutaneo e il derma fino all'epidermide. Queste fibre nervose correvano in fasci nel tessuto sottocutaneo ramificato all'interno del derma e terminato nell'epidermide.
Al contrario, la falloidina nei vasi sanguigni positivi e i vasi linfatici positivi LYVE-1 sono distribuiti nel tessuto sottocutaneo e nel derma. Generalmente le fibre nervose positive CGRP correvano parallele o circondate dai vasi sanguigni e dai vasi linfatici formando una rete 3D nella pelle pelosa e glabra. Con l'approccio convenzionale, sebbene i vasi sanguigni delle fibre nervose e i vasi linfatici fossero chiaramente etichettati con CGRP falloidina e LYVE-1 nelle sezioni sottili, l'osservazione di queste strutture era limitata dallo spessore della fetta e non può essere osservata completamente.
Nella sezione con uno spessore di 30 micrometri, non c'era differenza tra pelle pelosa e pelle glabra nella superficie delle fibre nervose positive CGRP. Nelle sezioni di tessuto spesse 300 micrometri, rispetto alla pelle pelosa, la superficie delle fibre nervose positive CGRP della pelle glabra è stata significativamente aumentata. È importante utilizzare il tampone di pulizia con un'elevata pressione osmotica dopo l'incubazione degli anticorpi.
Più volte, è necessario il tempo di pulizia richiesto per la colorazione immunofluorescenza. Seguendo questa procedura, riteniamo che esista anche la possibilità di colorazione e osservazione di altri tessuti e organi in sei sezioni. Questa tecnica potrebbe aiutare i ricercatori di neuroscienze a incontrare la superficie e lo stato delle fibre neurologiche.
Ci aiuta anche a osservare l'innovazione di tessuti e organi.
