우리의 프로토콜은 공초점 현미경을 사용하여 동기화 섹션을 관찰 할 수있는 실현 가능한 방법을 제공하여 신경 섬유의 관찰에서 정밀도를 보장 할 수있었습니다. 간단하고 쉬운 조직 청소 프로토콜은이 기술의 주요 장점입니다. 조직 청소 과정은 효율적이며 약 30 분에서 한 시간이 걸립니다.
텍스트 원고에 언급 된 바와 같이 안락사 된 쥐에 관류를 실시하십시오. 메스를 사용하여 뒷발에서 등받이와 발바닥의 피부를 제거하십시오. 냉동 절편을 필요로 하는 샘플의 경우, 조직을 0.1몰 PB의 알데히드로부터 4%로 고정시킨 후 두 시간 동안 고정시킨다.
세척 후 피부 조직을 섭씨 37도에서 2 % 아가로스에 넣고 냉각을 위해 아이스 박스 안에 넣으십시오. 장착 된 조직을 얼음물로 진동 마이크로 톤에 고정하고 횡단 방향으로 500 마이크로 미터의 두께로 슬라이스하십시오. 슬라이스 후, 절편으로부터 아가로스를 제거하고 1x PBS로 여섯 웰 플레이트에 보관한다.
조직 절편을 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 1x PBS 중의 2%트리톤 X-100의 용액으로 인큐베이션한다. 조직 절편을 블로킹 버퍼에 넣고 섭씨 네 도에서 하룻밤 사이에 쉐이커 위에서 분당 72회 회전으로 회전시킨다. 조직 절편을 마우스 모노클로날 항-CGRP 및 양 폴리클로날 항-LYVE-1 항체의 1차 항체를 포함하는 용액을 마이크로 원심분리 튜브의 희석 완충액 내로 옮긴다.
그런 다음 쉐이커에서 섭씨 네 도에서 이틀 동안 회전하십시오. 실온에서 세척 완충액으로 조직 절편을 두 번 세척한 다음, 세척 완충액에서 섭씨 네 도에서 밤새 진탕기에 보관하십시오. 다음날, 조직 절편을 이차 항체를 함유하는 혼합 용액으로 마이크로원심분리 튜브에 옮기고 섭씨 네 도에서 5시간 동안 진탕기 상에서 분당 72회 회전으로 회전시킨다.
여섯 웰 플레이트에서 조직 절편을 실온에서 한 시간 동안 세척 완충액으로 두 번 세척하십시오. 조직 절편을 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 쉐이커의 세척 완충액에 보관하십시오. 조직 절편을 조직 제거 시약 내로 옮기고 실온에서 한 시간 동안 쉐이커 상에서 분당 60회 회전으로 부드럽게 회전시킨다.
슬라이드에 맑은 조직을 장착한 다음 스페이서로 조직을 동그라미로 만들고 신선한 조직 제거 시약과 커버 슬립으로 틈새를 붙입니다. 3D 패턴은 CGRP 양성 신경 섬유가 피하 조직 및 진피를 통해 표피까지 통과한다는 것을 입증했습니다. 이들 신경 섬유는 진피 내에서 분지된 피하 조직에서 다발로 달렸고 표피에서 종결되었다.
대조적으로, 양성 혈관 및 LYVE-1 양성 림프관의 phalloidin은 피하 조직 및 진피에 분포한다. 일반적으로 CGRP 양성 신경 섬유는 혈관과 림프관과 평행하거나 둘러쌌으며 털이 많고 윤기가 나는 피부에서 3D 네트워크를 형성한다. 종래의 접근법으로, 신경 섬유 혈관과 림프관이 얇은 단면에서 CGRP phalloidin 및 LYVE-1로 명확하게 표지되었지만, 이러한 구조의 관찰은 슬라이스 두께에 의해 제한되었고 완전히 관찰 될 수 없었다.
두께가 30 마이크로미터인 구간에서, CGRP 양성 신경 섬유의 표면적에서 털이 많은 피부와 글라브루스 피부 사이에는 차이가 없었다. 300 마이크로미터 두께의 조직 절편에서, 털이 많은 피부와 비교하여, 글래브러스 피부의 CGRP 양성 신경 섬유의 표면적이 상당히 증가하였다. 항체 인큐베이션 후 높은 삼투압으로 세척 완충액을 사용하는 것이 중요합니다.
여러 번, 면역 형광 염색에 필요한 세척 시간이 필요하다. 이 절차에 따라, 우리는 여섯 섹션에서 다른 조직과 장기의 염색 및 관찰의 가능성이 또한 존재한다고 생각합니다. 이 기술은 신경 과학 연구자들이 표면적과 신경 섬유의 상태를 만나는 데 도움이 될 수 있습니다.
또한 조직과 기관의 혁신을 관찰하는 데 도움이됩니다.
