Nosso protocolo forneceu um método viável para observar a seção de sincronização usando microscópio confocal, o que poderia garantir precisão na observação das fibras nervosas. Protocolo simples e fácil de limpeza de tecidos é uma das principais vantagens dessa técnica. O processo de limpeza de tecidos é eficiente e leva cerca de 30 minutos a uma hora.
Conduta perfusão no rato eutanizado como mencionado no manuscrito do texto. Use um bisturi para remover a pele do dorso e sola da pata traseira. Para amostras que requerem uma seção congelada, corrija os tecidos em 4% de aldeído em PB molar de 0,1 por duas horas.
Após a lavagem, incorpore os tecidos da pele em 2% agarose a 37 graus Celsius e coloque-os dentro da caixa de gelo para resfriamento. Fixar o tecido montado na microtona vibratória com água gelada e cortá-los a uma espessura de 500 micrômetros na direção transversal. Após o corte, retire a agarose das seções e armazene-as em uma placa de seis poços com 1x PBS.
Incubar as seções teciduais em uma solução de 2%triton X-100 em 1x PBS durante a noite a quatro graus Celsius. Coloque as seções teciduais no tampão de bloqueio e gire a 72 rotações por minuto no agitador durante a noite a quatro graus Celsius. Transfira as seções teciduais para a solução contendo os anticorpos primários do anti-CGRP monoclonal do rato e do anticorpo anti-LYVE-1 de ovelha em tampão de diluição no tubo de micro centrífuga.
Em seguida, gire no shaker por dois dias a quatro graus Celsius. Lave as seções teciduais duas vezes com tampão de lavagem à temperatura ambiente, em seguida, mantenha-as no shaker durante a noite a quatro graus Celsius no tampão de lavagem. No dia seguinte, transfira as seções teciduais para a solução mista contendo os anticorpos secundários em um tubo de micro centrífugas e gire a 72 rotações por minuto no agitador por cinco horas a quatro graus Celsius.
Lave as seções de tecido em uma placa de seis poços com tampão de lavagem duas vezes por uma hora em temperatura ambiente. Mantenha as seções teciduais na lavagem do tampão no agitador durante a noite a quatro graus Celsius. Transfira as seções teciduais para o reagente de limpeza tecidual e gire a 60 rotações por minuto no agitador suavemente por uma hora à temperatura ambiente.
Monte os tecidos claros na lâmina, em seguida, circule os tecidos com um espaçador e coloque a lacuna com reagente de limpeza de tecido fresco e deslize de cobertura. O padrão 3D demonstrou que as fibras nervosas positivas CGRP passaram pelo tecido subcutâneo e derme para a epiderme. Estas fibras nervosas correram em feixes no tecido subcutâneo ramificado dentro da derme e terminadas na epiderme.
Em contraste, a faloidina nos vasos sanguíneos positivos e os vasos linfáticos positivos LYVE-1 estão distribuídos no tecido subcutâneo e na dermis. Geralmente, as fibras nervosas positivas CGRP corriam paralelamente ou cercavam os vasos sanguíneos e vasos linfáticos formando uma rede 3D na pele pelrosa e glabrous. Com a abordagem convencional, embora os vasos sanguíneos das fibras nervosas e vasos linfáticos tenham sido claramente rotulados com fábula CGRP e LYVE-1 nas seções finas, a observação dessas estruturas foi limitada pela espessura da fatia e não pode ser observada completamente.
Na seção com espessura de 30 micrômetros, não houve diferença entre pele pelrosa e pele glabrous na superfície das fibras nervosas positivas CGRP. Nas seções de tecido de 300 micrômetros de espessura, em comparação com a pele pelrosa, a área superficial das fibras nervosas positivas CGRP da pele glabrous foi significativamente aumentada. É importante usar o tampão de limpeza com alta pressão osmótica após a incubação de anticorpos.
Várias vezes, o tempo de limpeza necessário para a coloração da imunoexorescência é necessário. Após esse procedimento, acreditamos que existe também a possibilidade de coloração e observação de outros tecidos e órgãos em seis seções. Essa técnica poderia auxiliar pesquisadores de neurociência encontrando a área da superfície e o estado das fibras neurológicas.
Também nos ajuda a observar a inovação de tecidos e órgãos.
