从未受干扰和受伤的小鼠骨骼肌中分离和培养纤维脂肪祖细胞和肌肉干细胞的FACS-分离和培养

该协议描述了一种使用分选荧光激活剂同时分离纤维脂肪，祖细胞和肌肉干细胞的方法。这些细胞的纯群体是了解它们在生理和病理条件下的生物学作用的先决条件。使用这种技术，福布斯和肌肉干细胞被鉴定并从腋窝或受伤的肌肉中分离出来。

福布斯和肌肉干细胞的高饱满有罪不罚使我们能够将这些细胞用于不同的下游技术，如糖精移植和多混合分析。首先，将安乐死的小鼠仰卧位放在解剖垫上并喷洒70%乙醇为避免污染，使用镊子捏住小鼠腹部皮肤的中心并水平切开约一厘米的开口。抓住鼠标的伤口边缘和椎间盘，向相反方向拉动开口，露出下面的肌肉，露出后肢的一侧。

在收集肌肉之前，去除股四头肌近端腘绳肌之间的肌间脂肪，以改善纤维性脂肪祖细胞和肌肉干细胞的分离。接下来，在不损伤组织的情况下，使用锋利的镊子折断并剥离筋膜，以露出胫骨下前部或TA和趾伸肌或EDL肌肉。将镊子的尖头放在TA EDL肌肉下方，将肌肉从胫骨上分离。

切断肌腱，将 TA EDL 连接到脚踝，同时用镊子握住它，用剪刀沿着 TA EDL 的纵线修剪肌肉。切开膝盖周围的肌腱，分离整个TA EDL肌肉。将肌肉放在一个六厘米长的盘子里，放在冰上。

为了隔离腓肠肌，切断脚踝处的所有肌腱，并将肌肉与胫骨和腓骨分离。切开膝盖，将肌肉转移到盘子上。剥下股四头肌周围的筋膜，并通过在肌肉和骨骼之间运行镊子的尖锐尖端将其与股骨分开。

切断膝盖周围的肌腱，并通过沿着股骨切割来修剪其余肌肉，同时用镊子在远端握住股四头肌。将肌肉放在六厘米的盘子中。分离股骨周围的腿筋和剩余肌肉，并将其转移到盘子中。

将后肢肌肉收集在冰上的盘子中。从培养皿中吸出洗涤介质，加入一到两毫升肌肉解离缓冲液，以保持肌肉湿润。接下来，将肌肉彻底切碎 用手术刀撕裂和切片肌肉，然后用剪刀将肌肉不断切成小块一到两分钟，直到获得切碎组织的浆糊。

然后将切碎的肌肉转移到含有肌肉解离缓冲液的锥形管中。用实验室薄膜密封试管，并在37摄氏度的水浴中搅拌孵育一小时。一小时后，从摇床中取出试管并将其填充至50毫升 用洗涤介质，轻轻倒置试管两次以确保混合。

将细胞在水平桶转子中以 250 倍 G 在 4 摄氏度下离心五分钟。将42毫升上清液转移到两个新管中，并在原始管中留下8毫升。用洗涤介质填充含有21毫升上清液至50毫升的新管。

然后将细胞在 350 倍 G 下在 4 摄氏度下离心 8 分钟。吸出上清液并将颗粒保持在冰上。接下来，在含有八毫升肌肉解离缓冲液的原始管中加入一毫升胶原酶二储备液和一毫升二基原液。

使用5毫升血清移液管重悬沉淀10次而不会堵塞。将溶液喷射到管壁，避免形成气泡。用实验室薄膜密封试管，并在37摄氏度的水浴中搅拌30分钟。

30分钟后，从摇床吸出物中取出试管，并通过带有20号针头的10毫升注射器弹出肌肉悬浮液10次，用洗涤介质填充每个管最多50毫升并倒置管。然后在4摄氏度下以250倍G离心5分钟，并将上清液转移到新管中。在原管中留下八毫升。

用洗涤介质填充新管至50毫升，再次以350倍G在4摄氏度下离心细胞8分钟。除去上清液并将沉淀放在冰上。将 40 微米尼龙细胞过滤器放入装有 8 毫升洗涤介质的原始 50 毫升锥形管中，并用 1 至 2 毫升洗涤介质预润湿过滤器。

握住过滤器的同时，使用 10 毫升移液管轻轻重悬沉淀。通过细胞过滤器将悬浮液过滤回同一管中，以最大程度地减少细胞损失。通过向每个管中加入四到五毫升洗涤介质来将其他管颗粒过滤回原始管中，以重悬沉淀并将溶液转移到位于原始管中的自过滤器中。

将所有颗粒收集到原来的50毫升管中后，用另外4至5毫升洗涤介质冲洗自过滤器。使用1000微升移液器从自过滤器底部收集所有液体。用最多 50 毫升的洗涤介质填充每个管子，然后将管子倒置。

在 250 倍 G 下以 4 摄氏度离心管五分钟。立即除去上清液而不干扰沉淀，并将沉淀重悬于600微升洗涤介质中。将悬浮液转移到两毫升微量离心管中。

将抗体 CD 31 APC CD 45 APC SCA 一个太平洋蓝 VCAM 一个生物素和 α 7 整合素 PE 添加到含有细胞悬液的 2 毫米管中。将细胞在 4 摄氏度的旋转摇床中轻轻混合并孵育 45 分钟，保护它们免受光照。孵育后，用洗涤介质填充所有管最多两毫升，并在 250 倍 G 下以 4 摄氏度离心五分钟。

除去上清液并将沉淀重悬于300微升洗涤介质中。接下来，将链霉亲和素抗体添加到试管中，并将细胞在4摄氏度的旋转振荡器中孵育20分钟。孵育后，用洗涤介质将含有链霉亲和素抗体的试管填充至两毫升。

然后，离心管并完全吸出上清液。第二次洗涤后，将实验管中的细胞重悬于500微升洗涤培养基中。用 200 微升洗涤介质预润湿 5 毫升聚苯乙烯圆底管的细胞过滤器帽。

将细胞悬液从实验管转移到五毫升聚苯乙烯圆底管中，并使其通过重力过滤。用300微升洗涤介质打印含有实验样品悬浮液的两毫升管，并将其穿过相同的过滤器盖。使用200微升移液器从细胞过滤器底部收集所有液体。

用盖子密封，将管子放在冰上并保护它们免受光照。此处显示了用于分离纤维成脂祖细胞和肌肉干细胞的门控策略。报告小鼠中的PD GFR α E G F P敲击表达来自内源性PD G FFR Α位点的H two B E G F P融合基因，允许对PD G GFR Α谱系进行有效和特异性标记。

通过用PAC-7抗体对共培养的GFP阳性纤维成脂祖细胞和肌肉干细胞进行免疫染色，证实了分离细胞群的纯度。GFP阳性纤维成脂祖细胞不表达PAC-7标志物，而肌肉干细胞与该抗体发生反应。所有表达GFP的细胞均呈SCA 1阳性，CD 31，CD 45 VCAM一和α7整合素呈阴性。

显示了从损伤后七天肌内注射无毒素损伤的小鼠中分离出的纤维成脂祖细胞和肌肉干细胞。随着肌肉干细胞被激活，细胞大小增加。调整 F SCA 和 SS CA 参数并扩展门以将这些单元包含在中心非常重要。

此处显示了未受伤和受伤后 7 天 TA 肌肉中纤维脂肪生成祖细胞和肌肉干细胞的定量。尽管在第2天和第3天之间观察到峰值和增殖，但在损伤后7天仍然可以看到细胞的低增殖率。进行适当的肌肉切碎对于释放单个细胞至关重要。

此外，通过将悬浮液与带有20号针头的10毫升注射器运行来实现单核苷酸细胞分离。这项技术将帮助科学家在正常状态和肌肉再生的更深阶段研究福布斯和肌肉干细胞的生物转录和表观基因组谱。