このプロトコルは、ソーティングの蛍光活性化剤を使用して、脂肪形成性線維形成性、前駆細胞、および筋幹細胞を同時に単離するための方法を記載している。これらの細胞の純粋な集団は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的役割を理解するための前提条件です。この技術を使用して、フォーブスと筋幹細胞が同定され、脇の下または損傷した筋肉から分離されました。
フォーブスと筋幹細胞の高充填免責により、この細胞をサッカリン移植やムジアルミックス分析などのさまざまな下流技術に使用することができました。まず、安楽死させたマウスを解剖パッドに置き、70%エタノールをスプレーします 汚染を避けるために、鉗子を使用してマウスの腹の皮膚の中心をつまみ、水平方向に約1センチの開口部を切ります。マウスの傷口と椎間板をつかみ、開口部を反対方向に引っ張って下の筋肉を明らかにし、その時点で後肢の片側を露出させます。
筋肉を収集する前に, 大腿四頭筋の近位端のハムストリングス間の筋肉間脂肪を除去して、線維脂肪生成前駆細胞と筋幹細胞の分離を改善します.次に、組織を損傷することなく、鋭利な鉗子を使用して筋膜を壊して剥がし、前脛骨筋またはTAの下と長指伸筋またはEDL筋を露出させます。TA EDL筋肉の下に鉗子の鋭い先端を走らせて、脛骨から筋肉を切り離します。
腱を切り取り、TA EDLを足首に取り付け、鉗子で保持しながら、TA EDLの縦線に沿ってハサミで筋肉を整えます。膝の周りの腱を切断して、TA EDLの筋肉全体を切り離します。氷の上に置いた6センチの皿に筋肉を入れます。
腓腹筋を隔離するには、足首のすべての腱を切断し、脛骨と腓骨から筋肉を切り離します。膝の周りを切り、筋肉を皿に移します。大腿四頭筋の周りの筋膜をはがし、鉗子の鋭い先端を筋肉と骨の間に走らせて大腿骨から分離します。
膝の周りの腱を切断し、遠位端で大腿四頭筋を鉗子で保持しながら大腿骨に沿って切断することにより、残りの筋肉をトリミングします。筋肉を6センチの皿に入れます。ハムストリングスと大腿骨の周りの残りの筋肉を切り離し、それらを皿に移します。
氷の上に置いた皿に後肢の筋肉を集めます。皿から洗浄媒体を吸引し、筋肉を湿らせておくために1〜2ミリリットルの筋肉解離バッファーを追加します。次に、筋肉を徹底的に細かく刻みますメスを使用して筋肉を引き裂いてスライスし、ハサミを使用して筋肉を細かく切り分け、よく刻んだ組織のスラリーペーストが得られるまで1〜2分間筋肉を細かく切り続けます。
次に、細かく刻んだ筋肉を筋肉解離バッファーを含む円錐管に移します。チューブを実験室用フィルムで密封し、摂氏37度の水浴中で1時間撹拌しながらインキュベートする。1時間後、シェーカーからチューブを取り外し、50ミリリットルまで満たします 洗浄媒体で、チューブを2回静かに反転させて、確実に混合します。
スイングバケットローターでセルを250倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。42ミリリットルの上清を2つの新しいチューブに移し、元のチューブに8ミリリットルを残します。21ミリリットルまでの上清を含む新しいチューブに最大50ミリリットルを洗浄媒体で満たします。
次に、細胞を摂氏4度で8分間、350倍Gで遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを氷上に保つ。次に、8ミリリットルの筋解離バッファーを含む元のチューブに1ミリリットルのコラゲナーゼ2ストックと1ミリリットルのディスベースストックを追加します。
5ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、目詰まりすることなくペレットを10回再懸濁した。形成気泡を避けて、チューブの壁に向かって溶液を排出します。チューブを実験用フィルムで密封し、摂氏37度の水浴中で30分間攪拌しながらインキュベートします。
30分後、シェーカー吸引液からチューブを取り外し、20ゲージ針を備えた10ミリリットルのシリンジを通して筋肉懸濁液を10回排出し、各チューブを洗浄媒体で最大50ミリリットル満たし、チューブを反転させます。次に、摂氏4度で5分間250倍Gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。元のチューブに8ミリリットルを残します。
新しいチューブを最大50ミリリットルまで洗浄培地で満たし、再び細胞を摂氏4度で8分間350倍Gで遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを氷上に置いておきます。8ミリリットルの洗浄媒体を含む元の50ミリリットルの円錐管に40ミクロンのナイロンセルストレーナーを置き、1〜2ミリリットルの洗浄媒体でストレーナーを事前に湿らせます。
ストレーナーを保持しながら、10ミリリットルのピペットを使用してペレットを静かに再懸濁します。セルストレーナーを通して懸濁液をろ過して同じチューブに戻して、細胞の損失を最小限に抑えます。各チューブに4〜5ミリリットルの洗浄媒体を加えてペレットを再懸濁し、元のチューブに配置されたセルフストレーナーに溶液を移して、他のチューブペレットを元のチューブに戻します。
すべてのペレットを元の50ミリリットルのチューブに集めた後、セルフストレーナーをさらに4〜5ミリリットルの洗浄媒体ですすいでください。1000マイクロリットルのピペットを使用して、セルフストレーナーの下側からすべての液体を収集します。各チューブに最大50ミリリットルの洗浄媒体を満たし、チューブを反転させます。
チューブを摂氏4度で5分間、250倍Gで遠心分離します。ペレットを乱すことなく直ちに上清を除去し、ペレットを600マイクロリットルの洗浄媒体に再懸濁します。懸濁液を2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
抗体CD 31 APC CD 45 APC SCA 1 パシフィックブルー VCAM 1 ビオチンおよびアルファ 7 インテグリン PE を細胞懸濁液を含む 2 ミリメートルチューブに加えます。細胞を摂氏4度の回転シェーカーで45分間穏やかに混合してインキュベートし、光から細胞を保護します。インキュベーション後、2ミリリットルまでのすべてのチューブに洗浄培地を満たし、摂氏4度で5分間250倍Gで遠心分離します。
上清を除去し、ペレットを300マイクロリットルの洗浄媒体に再懸濁します。次に、ストレプトアビジン抗体をチューブに加え、回転するシェーカーで摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーション後、ストレプトアビジン抗体を2ミリリットルまで含むチューブを洗浄媒体で満たします。
次に、チューブを遠心分離し、上清を完全に吸引します。2回目の洗浄後、実験チューブ内の細胞を500マイクロリットルの洗浄培地に再懸濁する。5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブのセルストレーナーキャップを200マイクロリットルの洗浄媒体で事前に濡らします。
細胞懸濁液を実験チューブから5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに移し、重力でろ過できるようにします。実験サンプル懸濁液を含む2ミリリットルのチューブを300マイクロリットルの洗浄媒体で印刷し、同じストレーナーキャップに通します。200マイクロリットルのピペットを使用して、セルストレーナーの下側からすべての液体を収集します。
キャップで密封し、チューブを氷の上に置き、光から保護します。線維脂肪生成前駆細胞および筋幹細胞の単離に採用されたゲーティング戦略をここに示します。レポーターマウスにおけるPD GFRアルファEGF Pノックは、内因性PDG FFRアルファ遺伝子座由来のH二B E G F P融合遺伝子を発現し、PD G GFRアルファ系統の効率的かつ特異的な標識を可能にする。
単離した細胞集団の純度は、GFP陽性線維脂肪生成前駆細胞と筋幹細胞をPAC-7抗体で共培養する免疫染色により確認した。GFP陽性線維脂肪生成前駆細胞はPAC-7マーカーを発現しなかったが、筋幹細胞はこの抗体と反応した。すべてのGFP発現細胞は、SCA 1に対して陽性であり、CD 31、CD 45 VCAM1およびα7インテグリンに対して陰性であった。
損傷後7日目に無毒素の筋肉内注射で傷害を受けたマウスから単離された線維脂肪生成前駆細胞および筋幹細胞が示されている。筋幹細胞が活性化されると、細胞サイズが大きくなります。F SCA および SS CA パラメータを調整し、ゲートを拡張して中央のセルを含めることが重要です。
無傷および損傷後7日間のTA筋肉における線維脂肪生成前駆細胞および筋幹細胞の定量化をここに示します。ピークと増殖は2日目から3日目の間に観察されましたが、損傷後7日目でも細胞の増殖率は依然としてかなり高かったです。適切な筋肉ミンチを行うことは、単一の細胞を放出するために非常に重要です。
さらに、モノヌクレオチド細胞単離は、懸濁液を20ゲージの針を有する10ミリリットルのシリンジに流すことによって達成される。この技術は、科学者が正常な状態および筋肉再生のより深い段階でのフォーブスおよび筋幹細胞の生物学的転写およびエピゲノムプロファイルを研究するのに役立ちます。
