Este protocolo descreve um método para o isolamento simultâneo de fibro adipogênicos, progenitores e células-tronco musculares usando ativadores de fluorescência de classificação. Populações puras dessas células são um pré-requisito para entender seu papel biológico em condições fisiológicas e patológicas. Usando esta técnica, Forbes e células-tronco musculares foram identificados e isolados da axila ou músculo ferido.
A alta impunidade cheia de Forbes e células-tronco musculares nos permitiram usar essas células para diferentes técnicas a jusante, como transplante de sacarina e análise de mistura lamacenta. Para começar, coloque o supino de rato eutanizado em uma almofada de dissecção e pulverize-o com 70% de etanol Para evitar contaminação use fórceps para beliscar o centro da pele da barriga do rato e cortar aproximadamente um centímetro de abertura horizontalmente. Segure as bordas da ferida e o disco no mouse puxando a abertura nas direções opostas para descobrir os músculos por baixo, exponha um lado do membro traseiro no momento.
Antes de coletar músculos, Remova a gordura intermuscular entre os isquiotibiais na extremidade proximal do quadríceps para melhorar o isolamento de células progenitoras fibro adipogênicas e células-tronco musculares. Em seguida, sem danificar o tecido use fórceps afiados para quebrar e descascar a fáscia para expor os músculos tibialis anterior ou TA e extensor digitorum longus ou EDL. Execute a ponta afiada dos fórceps sob os músculos TA EDL para separar os músculos da tíbia.
Corte os tendões, anexando o TA EDL ao tornozelo e, ao segurá-lo com fórceps, corte os músculos com uma tesoura ao longo da linha longitudinal do TA EDL. Corte os tendões ao redor do joelho para desprender todos os músculos TA EDL. Coloque os músculos em uma antena de seis centímetros mantida no gelo.
Para isolar os músculos gastrocnemius cortar todos os tendões no tornozelo e desprender os músculos da tíbia e da fíbula. Corte ao redor do joelho e transfira os músculos para o prato. Retire a fáscia ao redor do quadríceps e separe-a do fêmur, executando a ponta afiada dos fórceps entre o músculo e o osso.
Corte os tendões ao redor do joelho e corte o resto do músculo cortando ao longo do fêmur enquanto segura o quadríceps com fórceps na extremidade distal. Coloque os músculos na antena de seis centímetros. Retire os tendões e os músculos remanescentes ao redor do fêmur e transfira-os para o prato.
Colete os músculos do membro traseiro em um prato mantido no gelo. Aspirar lavar médio do prato e adicionar um a dois mililitros de tampão de dissociação muscular para manter os músculos úmidos. Em seguida, pique os músculos use minuciosamente um bisturi para rasgar e cortar o músculo e, em seguida, use uma tesoura para continuar cortando o músculo em pequenos pedaços por um a dois minutos até obter uma pasta de chorume de tecido bem picado.
Em seguida, transfira os músculos picados para o tubo cônico contendo tampão de dissociação muscular. Sele os tubos com filme de laboratório e incuba em um banho de água de 37 graus Celsius com agitação por uma hora. Após uma hora, retire o tubo do agitador e encha-o a 50 mililitros Com meio de lavagem, inverta suavemente o tubo duas vezes para garantir a mistura.
Centrifugar as células em um rotor de balde balançando a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira 42 mililitros de supernascentes em dois novos tubos e deixe oito mililitros no tubo original. Encha os novos tubos contendo 21 mililitros do supernatante até 50 mililitros com meio de lavagem.
Em seguida, centrifugar as células a 350 vezes G por oito minutos a quatro graus Celsius. Aspire o supernatante e mantenha as pelotas no gelo. Em seguida, adicione um mililitro de colagens dois estoques e um mililitro de estoque baseado em dis no tubo original contendo oito mililitros de tampão de dissociação muscular.
Usando uma pipeta serológica de cinco mililitros resuspensa a pelota 10 vezes sem entupimento. Ejete a solução em direção à parede do tubo, evitando as bolhas de formação. Sele os tubos com filme de laboratório e incuba em um banho de água de 37 graus Celsius com agitação por 30 minutos.
Após 30 minutos, retire o tubo do shaker aspirado e ejete a suspensão muscular 10 vezes através de uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 20, encha cada tubo até 50 mililitros com meio de lavagem e inverta o tubo. Em seguida, centrífugas a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e transfira o supernante para um novo tubo. Deixando oito mililitros no tubo original.
Encha o novo tubo até 50 mililitros com meio de lavagem, novamente centrifugar as células a 350 vezes G por oito minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante e mantenha a pelota no gelo. Coloque um coador de células de nylon de 40 mícrons no tubo cônico original de 50 mililitros contendo oito mililitros de lavagem média e pré-molhado o coador com um a dois mililitros de meio de lavagem.
Enquanto segura o coador, use uma pipeta de 10 mililitros para resuspencar a pelota suavemente. Filtre a suspensão através do coador celular de volta para o mesmo tubo para minimizar a perda celular. Filtre as outras pelotas do tubo de volta para o tubo original adicionando quatro a cinco mililitros de meio de lavagem a cada tubo para resuspensar as pelotas e transferir a solução para o auto coador posicionado no tubo original.
Depois de coletar todas as pelotas no tubo original de 50 mililitros enxágue o coador auto com mais quatro a cinco mililitros de meio de lavagem. Use uma pipeta de 1000 microliter para coletar todo o líquido da parte inferior do coador. Encha cada tubo com meio de lavagem até 50 mililitros e inverta o tubo.
Centrifugar o tubo a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante imediatamente sem perturbar a pelota e resuspenja a pelota em 600 microliters de meio de lavagem. Transfira a suspensão para um tubo micro centrífuga de dois mililitros.
Adicione anticorpos CD 31 APC CD 45 APC SCA um Pacific Blue VCAM uma biotina e alfa sete Integrin PE em um tubo de dois milímetros contendo suspensão celular. Misture suavemente e incuba as células em um shaker rotativo a quatro graus Celsius por 45 minutos protegendo-as da luz. Após a incubação, encha todos os tubos até dois mililitros com meio de lavagem e centrífuga a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante e resuspenja a pelota em 300 microliters de meio de lavagem. Em seguida, adicione anticorpo streptavidin em tubos e incuba as células em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, encha os tubos contendo anticorpo streptavidin a dois mililitros com meio de lavagem.
Em seguida, centrifugar os tubos e aspirar o supernasal completamente. Após a segunda lavagem, resuspenja as células no tubo experimental em 500 microliters de meio de lavagem. Pré-molhado uma tampa de coador celular de um tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros com 200 microliters de meio de lavagem.
Transfira a suspensão celular do tubo experimental para o tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros e deixe filtrar por gravidade. Imprima o tubo de dois mililitros contendo a suspensão experimental da amostra com 300 microliters de meio de lavagem e passe-o através da mesma tampa do filtro. Use uma pipeta de 200 microliter para coletar todo o líquido da parte inferior do coador celular.
Sele com uma tampa, deixe tubos no gelo e proteja-os da luz. A estratégia de gating adotada para o isolamento de progenitores fibro adipogênicos e células-tronco musculares é mostrada aqui. O PD GFR alfa E G F P knock in reporter mice expressa o gene de fusão H two B E G F P do lócus alfa PD G FFR, permitindo rotulagem eficiente e específica da linhagem alfa PD G GFR.
A pureza das populações celulares isoladas foi confirmada pela coloração imuno-cultura GFP progenitora progenitora progenia adipogênica e células-tronco musculares com anticorpos PAC-sete. O progenitor adipogênico fibro adipogênico GFP não expressou o marcador PAC-seven, enquanto as células-tronco musculares reagiram com este anticorpo. Todas as células de expressão de GFP foram positivas para SCA um e negativas para CD 31, CD 45 VCAM um e alfa sete integrin.
O progenitor adipogênico fibro e células-tronco musculares isolados de camundongos feridos com injeções intramusculares sem toxina sete dias após a lesão são mostrados. À medida que as células-tronco musculares são ativadas, um aumento no tamanho celular. É importante ajustar os parâmetros F SCA e SS CA e expandir o portão para incluir essas células no centro.
Quantificação de progenitora fibro adipogênica e células-tronco musculares em músculos não feridos e sete dias de músculos TA pós-lesão são mostrados aqui. Embora o pico e a proliferação tenham sido observados entre os dias dois e três, uma baixa taxa de células proliferadoras ainda era apreciável sete dias após a lesão. Realizar um bom picar o músculo é de fundamental importância para liberar uma única célula.
Além disso, o isolamento celular mononucleotídeo é alcançado executando a suspensão a uma seringa de 10 mililitros com uma agulha calibre 20. Essa técnica ajudará os cientistas a estudar o perfil histórico transcricional e epigenômico da Forbes e células-tronco musculares em condições normais e durante os estágios mais profundos da regeneração muscular.
