פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד סימולטני של תאי גזע פיברו-אדיפוגניים, אבות ותאי גזע של שרירים באמצעות מפעילי פלואורסצנטיות של מיון. אוכלוסיות טהורות של תאים אלה הן תנאי מוקדם להבנת תפקידם הביולוגי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. באמצעות טכניקה זו, פורבס ותאי גזע של שרירים זוהו ובודדו מבית השחי או משריר פצוע.
החסינות הגבוהה של פורבס ותאי גזע של שרירים אפשרה לנו להשתמש בתאים אלה לטכניקות שונות במורד הזרם כגון השתלת סכרין וניתוח תערובת בוציאלית. כדי להתחיל, מניחים את העכבר המומת על כרית דיסקציה ומרססים אותו ב-70% אתנול כדי למנוע זיהום השתמשו במלקחיים כדי לצבוט את מרכז עור בטן העכבר וחתכו כסנטימטר פתיחה אופקית. תפסו את קצוות הפצע ואת הדיסק בעכבר על ידי משיכת הפתח בכיוונים הפוכים כדי לחשוף את השרירים שמתחת, וחשפו צד אחד של הגפה האחורית באותו זמן.
לפני איסוף השרירים, הסר שומן בין-שרירי בין ההמסטרינגים בקצה הפרוקסימלי של הארבע ראשי כדי לשפר את הבידוד של תאי אב פיברו אדיפוגניים ותאי גזע שריר. לאחר מכן, מבלי לפגוע ברקמה השתמש במלקחיים חדים כדי לשבור ולקלף את החיתולית כדי לחשוף את שרירי הטיביאליס הקדמיים או TA ו- extensor digitorum longus או EDL. הפעל את הקצה החד של המלקחיים מתחת לשרירי TA EDL כדי לנתק את השרירים מהטיביה.
חותכים את הגידים, מחברים את ה- TA EDL לקרסול ותוך כדי החזקתו במלקחיים, חותכים את השרירים במספריים לאורך קו האורך של ה- TA EDL. חותכים את הגידים סביב הברך כדי לנתק את כל שרירי ה-TA EDL. מניחים את השרירים בצלחת של שישה סנטימטרים שנשמרת על קרח.
כדי לבודד את שרירי הגסטרוקנמיוס חותכים את כל הגידים בקרסול ומנתקים את השרירים מהטיביה והפיבולה. חותכים סביב הברך ומעבירים את השרירים לצלחת. לקלף את החיתולית סביב quadriceps ולהפריד אותו מן עצם הירך על ידי הפעלת הקצה החד של מלקחיים בין השריר והעצם.
חותכים את הגידים סביב הברך וחותכים את שאר השריר על ידי חיתוך לאורך עצם הירך תוך החזקת הארבע ראשי עם מלקחיים בקצה הדיסטלי. מניחים את השרירים בצלחת של שישה סנטימטרים. נתקו את שרירי ההמסטרינג והשרירים הנותרים סביב עצם הירך והעבירו אותם לצלחת.
לאסוף את שרירי הגפיים האחוריות בצלחת שנשמרה על קרח. שאפו לשטוף בינוני מן המנה ולהוסיף אחד עד שני מיליליטר של חיץ דיסוציאציה שריר כדי לשמור על השרירים לחים. לאחר מכן, טחון שרירים ביסודיות השתמש באזמל כדי לקרוע ולפרוס את השריר ולאחר מכן להשתמש מספריים כדי להמשיך לחתוך את השריר לחתיכות קטנות במשך דקה עד שתי דקות עד לקבלת הדבק slurry של רקמה טחון היטב.
לאחר מכן מעבירים את השרירים הטחונים לצינור החרוטי המכיל חיץ דיסוציאציה שרירי. אוטמים את הצינורות עם סרט מעבדה ודוגרים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה למשך שעה. לאחר שעה, הסר את הצינור מהשייקר ומלא אותו ל -50 מיליליטר עם מדיום כביסה, הפוך בעדינות את הצינור פעמיים כדי להבטיח ערבוב.
צנטריפוגה של התאים בדלי מתנדנד רוטור ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים 42 מיליליטר של סופרנאטנט לשני צינורות חדשים ומשאירים שמונה מיליליטר בצינור המקורי. מלאו את הצינורות החדשים המכילים 21 מיליליטר של הסופרנטנט עד 50 מיליליטר במדיום כביסה.
לאחר מכן צנטריפוגה של התאים ב 350 פעמים G במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופר-נאטנט ושמרו את הכדורים על הקרח. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של collagenases שני מלאי ומיליליטר אחד של מלאי מבוסס דיס בצינור המקורי המכיל שמונה מיליליטר של חיץ דיסוציאציה שרירית.
באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר יש להשעות את הכדור 10 פעמים ללא סתימה. לפלוט את התמיסה לכיוון הקיר של הצינור, הימנעות בועות היווצרות. אטמו את הצינורות עם סרט מעבדה ודגרו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה במשך 30 דקות.
לאחר 30 דקות, הסר את הצינור מן השייקר לשאוף ולהוציא את ההשעיה שריר 10 פעמים דרך מזרק 10 מיליליטר עם מחט 20 מד, למלא כל צינור עד 50 מיליליטר עם בינוני לשטוף ולהפוך את הצינור. לאחר מכן צנטריפוגה ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatant לתוך צינור חדש. השארת שמונה מיליליטר בצינור המקורי.
למלא את הצינור החדש עד 50 מיליליטר עם מדיום לשטוף, שוב צנטריפוגה את התאים ב 350 פעמים G במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים את הסופר-נאטנט ושומרים את הכדור על הקרח. מניחים מסננת תאי ניילון בגודל 40 מיקרון בצינור החרוטי המקורי של 50 מיליליטר המכילה שמונה מיליליטר של מדיום שטיפה ומרטיבים מראש את המסננת במיליליטר אחד עד שניים של מדיום כביסה.
תוך כדי החזקת המסננת, השתמש פיפטה של 10 מיליליטר כדי להשהות את הכדור בעדינות. סנן את המתלה דרך מסננת התא בחזרה לאותה צינור כדי למזער את אובדן התא. סנן את כדורי הצינור האחרים בחזרה לצינור המקורי על ידי הוספת ארבעה עד חמישה מיליליטרים של מדיום כביסה לכל צינור כדי להשעות מחדש את הכדורים ולהעביר את התמיסה למסננת העצמית הממוקמת בצינור המקורי.
לאחר איסוף כל הכדורים לתוך צינור המקורי 50 מיליליטר לשטוף את המסננת העצמית עם עוד ארבעה עד חמישה מיליליטר של מדיום לשטוף. השתמש פיפטה 1000 microliter כדי לאסוף את כל הנוזלים מן החלק התחתון של מסננת עצמית. מלא כל צינור עם בינוני לשטוף עד 50 מיליליטר ולהפוך את הצינור.
צנטריפוגה את הצינור ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מיד מבלי להפריע את הכדור ו resuse את הכדור ב 600 microliters של מדיום לשטוף. מעבירים את המתלים לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר.
הוסף נוגדנים CD 31 APC CD 45 APC SCA אחד פסיפיק כחול VCAM אחד ביוטין ואלפא שבע Integrin PE לתוך צינור שני מילימטר המכיל תרחיף תאים. מערבבים בעדינות ודוגרים את התאים בשייקר מסתובב בארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות כדי להגן עליהם מפני אור. לאחר הדגירה, למלא את כל הצינורות עד שני מיליליטר עם בינוני לשטוף צנטריפוגה ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הסר את supernatant ו resuse את הכדור ב 300 microliters של מדיום לשטוף. לאחר מכן, יש להוסיף נוגדן סטרפטווידין לצינורות ולדגור על התאים בשייקר מסתובב בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, צינורות מילוי המכילים נוגדן סטרפטווידין לשני מיליליטר עם מדיום כביסה.
לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ולשאוף את supernatant לחלוטין. לאחר השטיפה השנייה, יש להשעות את התאים בצינור הניסוי ב-500 מיקרוליטרים של מדיום הכביסה. יש להרטיב מראש מכסה מסננת תא של צינור תחתון עגול של חמישה מיליליטר פוליסטירן עם 200 מיקרוליטר של מדיום כביסה.
העבירו את מתלה התא מצינור הניסוי לצינור התחתון העגול של חמישה מיליליטר פוליסטירן ואפשרו לו לסנן לפי כוח הכבידה. הדפיסו את צינור שני המיליליטר המכיל את מתלה הדגימה הניסיוני עם 300 מיקרוליטר של מדיום כביסה והעבירו אותו דרך אותו מכסה מסננת. השתמש פיפטה 200 microliter כדי לאסוף את כל הנוזל מן החלק התחתון של מסננת התא.
לאטום עם כובע, להשאיר צינורות על קרח ולהגן עליהם מפני אור. אסטרטגיית ה-gating שאומצה לבידוד של תאי אב ותאי גזע של שריר פיברו אדיפוגניים מוצגת כאן. ה- PD GFR alpha E G F P לדפוק בעכברים מדווחים מבטא את גן ההיתוך H two B E G F P מתוך לוקוס אלפא PD G FFR אנדוגני, ומאפשר תיוג יעיל וספציפי של שושלת האלפא PD G GFR.
טוהר אוכלוסיות התאים המבודדים אושר על ידי צביעה חיסונית של תרבית משותפת GFP חיובית פיברו אדיפוגנית ותאי גזע שרירים עם נוגדני PAC-7. אב פיברו אדיפוגני חיובי ל-GFP לא ביטא את סמן PAC-7, בעוד שתאי גזע שריריים הגיבו עם נוגדן זה. כל התאים המבטאים GFP היו חיוביים עבור SCA אחד ושליליים עבור CD 31, CD 45 VCAM אחד ואלפא שבע integrin.
מוצגים תאי האב ותאי גזע השריריים של פיברו אדיפוגניים שבודדו מעכברים שנפצעו בזריקות תוך שריריות ללא רעלן שבעה ימים לאחר הפציעה. ככל שתאי גזע שריר מופעלים עלייה בגודל התא. חשוב להתאים את הפרמטרים F SCA ו- SS CA ולהרחיב את השער כך שיכלול תאים אלה במרכז.
כימות של תאי אב ותאי גזע של שרירים פיברו אדיפוגניים בשרירי TA שלא נפגעו ושבעה ימים לאחר הפציעה מוצגים כאן. למרות שהשיא וההתרבות נצפו בין הימים השני לשלושה, עדיין ניתן היה להבחין בשיעור נמוך של תאים מתרבים שבעה ימים לאחר הפציעה. ביצוע ניקוי שרירים תקין הוא בעל חשיבות קריטית לשחרור תאים בודדים.
יתר על כן, בידוד תאי מונונוקלאוטיד מושג על ידי הפעלת המתלה למזרק 10 מיליליטר עם מחט 20 מדודה. טכניקה זו תסייע למדענים לחקור את פרופיל השעתוק הביולוגי והאפיגנומי של פורבס ותאי גזע של שרירים במצב תקין ובשלבים העמוקים יותר של התחדשות השרירים.
