يصف هذا البروتوكول طريقة للعزل المتزامن للخلايا الشحمية الليفية والأسلاف والخلايا الجذعية العضلية باستخدام منشطات التألق للفرز. السكان النقيون لهذه الخلايا هم شرط أساسي لفهم دورها البيولوجي في الظروف الفسيولوجية والمرضية. باستخدام هذه التقنية ، تم تحديد فوربس والخلايا الجذعية العضلية وعزلها إما عن الإبط أو العضلات المصابة.
وقد سمح لنا الإفلات من العقاب المليء بفوربس والخلايا الجذعية العضلية باستخدام هذه الخلايا لتقنيات مختلفة في اتجاه مجرى النهر مثل زرع السكرين وتحليل المزيج الطيني. للبدء ، ضع الفأر المقتول على وسادة تشريح ورشها بالإيثانول بنسبة 70٪ لتجنب التلوث ، استخدم الملقط لقرص مركز جلد بطن الفأر وقطع فتحة سنتيمتر واحد تقريبا أفقيا. أمسك حواف الجرح والقرص في الماوس عن طريق سحب الفتحة في الاتجاهين المعاكسين للكشف عن العضلات الموجودة تحتها ، وكشف جانب واحد من الطرف الخلفي في ذلك الوقت.
قبل جمع العضلات، قم بإزالة الدهون بين العضلات بين أوتار الركبة في الطرف القريب من العضلة رباعية الرؤوس لتحسين عزل الخلايا السلفية الليفية الشحمية المنشأ والخلايا الجذعية العضلية. بعد ذلك ، دون الإضرار بالأنسجة ، استخدم ملقطا حادا لكسر اللفافة وتقشيرها لفضح عضلات الظنبوب الأمامية أو TA والباسطة الرقمية الطويلة أو EDL. قم بتشغيل الطرف الحاد من الملقط أسفل عضلات TA EDL لفصل العضلات عن الساق.
قم بقطع الأوتار ، وربط TA EDL بالكاحل وأثناء حمله بالملقط ، قم بقص العضلات بمقص على طول الخط الطولي ل TA EDL. قطع الأوتار حول الركبة لفصل عضلات TA EDL بأكملها. ضع العضلات في طبق طوله ستة سنتيمترات محفوظ على الجليد.
لعزل عضلات المعدة قطع جميع الأوتار في الكاحل وفصل العضلات عن الساق والشظية. قطع حول الركبة ونقل العضلات إلى الطبق. قشر اللفافة حول العضلة رباعية الرؤوس وافصلها عن عظم الفخذ عن طريق تشغيل الطرف الحاد من الملقط بين العضلات والعظام.
قطع الأوتار حول الركبة وتقليم بقية العضلات عن طريق قطع على طول عظم الفخذ مع عقد العضلة رباعية الرؤوس مع ملقط في الطرف البعيد. ضع العضلات في طبق الستة سنتيمترات. افصل أوتار الركبة والعضلات المتبقية حول عظم الفخذ وانقلها إلى الطبق.
اجمع عضلات الأطراف الخلفية في طبق محفوظ على الجليد. اغسل الشفط وسط من الطبق وأضف واحدا إلى ملليلترين من عازل تفكك العضلات للحفاظ على رطوبة العضلات. بعد ذلك ، قم بتقطيع العضلات جيدا استخدم مشرطا لتمزيق العضلات وتقطيعها إلى شرائح ثم استخدم المقص للحفاظ على قطع العضلات إلى قطع صغيرة لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى الحصول على عجينة ملاط من الأنسجة المفرومة جيدا.
ثم انقل العضلات المفرومة إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عازل تفكك العضلات. أغلق الأنابيب بفيلم مختبري واحتضنها في حمام مائي 37 درجة مئوية مع إثارة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة الأنبوب من الخلاط واملأه إلى 50 ملليلتر مع وسط الغسيل ، وعكس الأنبوب بلطف مرتين لضمان الخلط.
الطرد المركزي للخلايا في دوار دلو متأرجح عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل 42 ملليلتر من supernatant إلى أنبوبين جديدين واترك ثمانية ملليلترات في الأنبوب الأصلي. املأ الأنابيب الجديدة التي تحتوي على 21 ملليلتر من supernatant حتى 50 ملليلتر بوسط غسيل.
ثم الطرد المركزي للخلايا في 350 مرة G لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. شفط supernatant والحفاظ على الكريات على الجليد. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من الكولاجيناز اثنين من الأسهم وملليلتر واحد من الأسهم القائمة على ديس في الأنبوب الأصلي الذي يحتوي على ثمانية ملليلتر من العازلة لتفكك العضلات.
باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر ، أعد تعليق الكريات 10 مرات دون انسداد. أخرج المحلول نحو جدار الأنبوب ، وتجنب فقاعات التكوين. أغلق الأنابيب بفيلم مختبري واحتضنها في حمام مائي 37 درجة مئوية مع الإثارة لمدة 30 دقيقة.
بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الأنبوب من شفط الاهتزاز وإخراج تعليق العضلات 10 مرات من خلال حقنة 10 ملليلتر بإبرة قياس 20 ، واملأ كل أنبوب يصل إلى 50 ملليلتر بوسط غسيل وعكس الأنبوب. ثم جهاز طرد مركزي بسرعة 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ونقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد. ترك ثمانية ملليلتر في الأنبوب الأصلي.
املأ الأنبوب الجديد حتى 50 ملليلتر بوسط غسيل ، وقم مرة أخرى بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 350 مرة G لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. إزالة supernatant والحفاظ على بيليه على الجليد. ضع مصفاة خلايا نايلون 40 ميكرون في الأنبوب المخروطي الأصلي سعة 50 ملليلتر الذي يحتوي على ثمانية ملليلترات من وسط الغسيل وقم بترطيب المصفاة مسبقا بواحد إلى ملليلتر من وسط الغسيل.
أثناء حمل المصفاة ، استخدم ماصة 10 ملليلتر لإعادة تعليق الكريات بلطف. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة الخلية مرة أخرى إلى نفس الأنبوب لتقليل فقدان الخلية. قم بتصفية كريات الأنبوب الأخرى مرة أخرى إلى الأنبوب الأصلي عن طريق إضافة أربعة إلى خمسة ملليلترات من وسط الغسيل إلى كل أنبوب لإعادة تعليق الكريات ونقل المحلول إلى المصفاة الذاتية الموضوعة في الأنبوب الأصلي.
بعد جمع جميع الكريات في أنبوب 50 ملليلتر الأصلي شطف المصفاة الذاتية مع أربعة إلى خمسة ملليلترات أخرى من وسط الغسيل. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لجمع كل السائل من الجانب السفلي من المصفاة الذاتية. املأ كل أنبوب بوسط غسيل يصل إلى 50 ملليلتر وعكس الأنبوب.
جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة السوبرناتانت على الفور دون إزعاج الكريات وأعد تعليق الكريات في 600 ميكرولتر من وسط الغسيل. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة مليلترين.
أضف الأجسام المضادة CD 31 APC CD 45 APC SCA واحد المحيط الهادئ الأزرق VCAM واحد البيوتين وألفا سبعة Integrin PE في أنبوب اثنين ملليمترات تحتوي على تعليق الخلية. اخلطي الخلايا بلطف واحتضنيها في شاكر دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة لحمايتها من الضوء. بعد الحضانة ، املأ جميع الأنابيب حتى ملليلترين بوسط الغسيل وأجهزة الطرد المركزي عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
قم بإزالة السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من وسط الغسيل. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد للستربتافيدين إلى الأنابيب واحتضن الخلايا في شاكر دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، املأ الأنابيب التي تحتوي على جسم مضاد للستربتافيدين إلى ملليلترين مع وسط الغسيل.
ثم ، الطرد المركزي للأنابيب وشفط supernatant تماما. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخلايا في الأنبوب التجريبي في 500 ميكرولتر من وسط الغسيل. قبل البلل غطاء مصفاة الخلية من أنبوب سفلي دائري من البوليسترين سعة خمسة ملليلتر مع 200 ميكرولتر من وسط الغسيل.
انقل تعليق الخلية من الأنبوب التجريبي إلى الأنبوب السفلي المستدير من البوليسترين سعة خمسة ملليلتر واسمح له بالتصفية حسب الجاذبية. اطبع أنبوبي الملليلتر اللذين يحتويان على تعليق العينة التجريبي مع 300 ميكرولتر من وسط الغسيل ومرره عبر نفس غطاء المصفاة. استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لجمع كل السائل من الجانب السفلي من مصفاة الخلية.
ختم مع غطاء ، وترك أنابيب على الجليد وحمايتها من الضوء. تظهر هنا استراتيجية البوابة المعتمدة لعزل السلف الشحمي الليفي والخلايا الجذعية العضلية. يعبر PD GFR alpha E G F P في الفئران المراسلة عن جين الاندماج H two B E G F P من موضع PD G FFR ألفا الداخلي ، مما يسمح بوضع علامات فعالة ومحددة على سلالة PD G GFR ألفا.
تم تأكيد نقاء مجموعات الخلايا المعزولة من خلال التلطيخ المناعي للسلف الليفي الدهني الإيجابي GFP والخلايا الجذعية العضلية مع الأجسام المضادة PAC-seven. لم يعبر السلف الليفي الدهني الإيجابي GFP عن علامة PAC-seven ، في حين تفاعلت الخلايا الجذعية العضلية مع هذا الجسم المضاد. كانت جميع الخلايا المعبرة عن GFP إيجابية ل SCA one وسلبية ل CD 31 و CD 45 VCAM one و alpha seven integrin.
يتم عرض السلف الليفي الشحمي المنشأ والخلايا الجذعية العضلية المعزولة من الفئران المصابة بالحقن العضلي بدون سم بعد سبعة أيام من الإصابة. كما يتم تنشيط الخلايا الجذعية العضلات زيادة في حجم الخلايا. من المهم ضبط معلمات F SCA و SS CA وتوسيع البوابة لتشمل تلك الخلايا في المركز.
يظهر هنا تحديد كمية السلف الليفي الشحمي المنشأ والخلايا الجذعية العضلية في عضلات TA غير المصابة وبعد سبعة أيام من الإصابة. وعلى الرغم من أن الذروة والانتشار لوحظا بين اليومين الثاني والثالث، إلا أن المعدل المنخفض للخلايا المتكاثرة لا يزال ملحوظا بعد سبعة أيام من الإصابة. يعد إجراء فرم العضلات المناسب أمرا بالغ الأهمية لإطلاق خلية واحدة.
علاوة على ذلك ، يتم تحقيق عزل الخلايا أحادية النوكليوتيد عن طريق تشغيل التعليق إلى حقنة 10 ملليلتر بإبرة قياس 20. ستساعد هذه التقنية العلماء على دراسة النسخ البيولوجي والملف الجيني لفوربس والخلايا الجذعية العضلية في حالة طبيعية وخلال المراحل الأعمق من تجديد العضلات.
