Этот протокол описывает метод одновременного выделения фиброадипогенных, прогениторных и мышечных стволовых клеток с использованием флуоресцентных активаторов сортировки. Чистые популяции этих клеток являются предпосылкой для понимания их биологической роли в физиологических и патологических состояниях. Используя эту технику, Forbes и мышечные стволовые клетки были идентифицированы и выделены либо из подмышечной впадины, либо из поврежденной мышцы.
Высокая безнаказанность Forbes и мышечных стволовых клеток позволила нам использовать эти клетки для различных методов, таких как трансплантация сахарина и анализ мудиальной смеси. Для начала поместите усыпленную мышь лежа на спине на подушечке для рассечения и опрыскайте ее 70% этанолом Чтобы избежать загрязнения, используйте щипцы, чтобы защипать центр кожи живота мыши и разрезать примерно на один сантиметр отверстие горизонтально. Захватите края раны и диск в мыши, потянув отверстие в противоположных направлениях, чтобы раскрыть мышцы под ним, обнажите одну сторону задней конечности в то время.
Перед сбором мышц удалите межмышечный жир между подколенными сухожилиями в проксимальном конце квадрицепсов, чтобы улучшить выделение фиброадипогенных клеток-предшественников и мышечных стволовых клеток. Затем, не повреждая ткань, используйте острые щипцы, чтобы сломать и отклеить фасцию, чтобы обнажить нижнюю часть большеберцовой кости передней или ТА и разгибатель digitorum longus или EDL мышцы. Запустите острый кончик щипцов под мышцами TA EDL, чтобы отделить мышцы от большеберцовой кости.
Отрежьте сухожилия, прикрепив TA EDL к лодыжке и, удерживая ее щипцами, обрежьте ножницами мышцы вдоль продольной линии TA EDL. Отрежьте сухожилия вокруг колена, чтобы отделить все мышцы TA EDL. Поместите мышцы в шестисантиметровое блюдо, хранящееся на льду.
Для изоляции икроножных мышц отрежьте все сухожилия на лодыжке и отделите мышцы от большеберцовой и малоберцовой костей. Обрежьте вокруг колена и перенесите мышцы к блюду. Очистите фасцию вокруг квадрицепсов и отделите ее от бедренной кости, проведя острым кончиком щипцов между мышцей и костью.
Обрежьте сухожилия вокруг колена и обрежьте остальную часть мышцы, разрезав вдоль бедренной кости, удерживая квадрицепсы щипцами на дистальном конце. Поместите мышцы в шестисантиметровое блюдо. Отсоедините подколенные сухожилия и оставшиеся мышцы вокруг бедренной кости и перенесите их в блюдо.
Соберите мышцы задних конечностей в блюдо, хранящееся на льду. Аспират смойте среду из посуды и добавьте один-два миллилитра буфера диссоциации мышц, чтобы сохранить мышцы влажными. Затем тщательно измельчите мышцы Используйте скальпель, чтобы разорвать и разрезать мышцу, а затем используйте ножницы, чтобы продолжать разрезать мышцу на мелкие кусочки в течение одной-двух минут до получения суспензионной пасты из хорошо измельченной ткани.
Затем переместите измельченные мышцы в коническую трубку, содержащую буфер диссоциации мышц. Запечатайте пробирки лабораторной пленкой и высиживайте на водяной бане 37 градусов Цельсия с перемешиванием в течение одного часа. Через час извлеките трубку из шейкера и заполните ее до 50 миллилитров С помощью моющего средства осторожно переверните трубку дважды, чтобы обеспечить перемешивание.
Центрифугируйте ячейки в качающемся роторе ведра при 250 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Переложите 42 миллилитра супернатанта в две новые трубки и оставьте восемь миллилитров в исходной трубке. Наполните новые пробирки, содержащие 21 миллилитр супернатанта до 50 миллилитров, моющей средой.
Затем центрифугируют клетки в 350 раз G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте супернатант и держите гранулы на льду. Затем добавьте один миллилитр коллагеназ, два запаса и один миллилитр дис-основе в оригинальную трубку, содержащую восемь миллилитров буфера диссоциации мышц.
С помощью пятимиллилитровой серологической пипетки повторно суспендируют гранулу 10 раз без засорения. Выталкивайте раствор к стенке трубки, избегая образования пузырьков. Запечатайте пробирки лабораторной пленкой и вынашивайте на водяной бане 37 градусов Цельсия с перемешиванием в течение 30 минут.
Через 30 минут извлеките трубку из шейкера аспирата и вытолкните мышечную суспензию 10 раз через шприц объемом 10 миллилитров с помощью иглы 20 калибра, заполните каждый тюбик до 50 миллилитров моющей средой и переверните трубку. Затем центрифугируют в 250 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и переносят супернатант в новую трубку. Оставляя восемь миллилитров в оригинальной трубке.
Заполните новую трубку до 50 миллилитров моющей средой, снова центрифугируйте ячейки в 350 раз G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант и держите гранулу на льду. Поместите 40-микронный нейлоновый клеточный сетчатый фильтр в оригинальную коническую трубку размером 50 миллилитров, содержащую восемь миллилитров моющей среды, и предварительно смочите ситечко с одним-двумя миллилитрами моющей среды.
Удерживая ситечко, используйте 10-миллилитровую пипетку, чтобы аккуратно повторно использовать гранулу. Фильтруйте суспензию через клеточный сетчатый фильтр обратно в ту же трубку, чтобы свести к минимуму потерю клеток. Отфильтруйте другие гранулы трубки обратно в исходную трубку, добавив четыре-пять миллилитров промывочной среды в каждую трубку, чтобы повторно суспендировать гранулы и перенести раствор в самосектор, расположенный в исходной трубке.
После сбора всех гранул в оригинальную 50-миллилитровую трубку промойте самосетчатый фильтр еще четырьмя-пятью миллилитрами промывочной среды. Используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны ситечка. Наполните каждый тюбик промывочной средой до 50 миллилитров и переверните трубку.
Центрифугируйте трубку в 250 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Немедленно удалите супернатант, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте гранулу в 600 микролитрах моющей среды. Перенесите суспензию в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку.
Добавьте антитела CD 31 APC CD 45 APC SCA один Pacific Blue VCAM один биотин и альфа семь Integrin PE в двухмиллиметровую трубку, содержащую клеточную суспензию. Осторожно перемешайте и инкубируйте клетки во вращающемся шейкере при четырех градусах Цельсия в течение 45 минут, защищая их от света. После инкубации заполните все пробирки до двух миллилитров моющей средой и центрифугой в 250 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 300 микролитров моющей среды. Затем добавьте антитело к стрептавидину в пробирки и инкубируйте клетки во вращающемся шейкере при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. После инкубации наполните пробирки, содержащие антитело стрептавидина, до двух миллилитров промывной средой.
Затем центрифугируйте трубки и полностью аспирируйте супернатант. После второй промывки повторно суспендируют клетки в экспериментальной трубке в 500 микролитрах промывочной среды. Предварительно смочите крышку клеточного сетчатого фильтра из пятимиллилитровой полистирольной трубки круглого дна с 200 микролитрами промывочной среды.
Переместите клеточную суспензию из экспериментальной трубки в пятимиллилитровую полистирольную трубку круглого дна и дайте ей фильтровать под действием силы тяжести. Распечатайте двухмиллилитровую трубку, содержащую экспериментальный образец суспензии с 300 микролитрами промывочной среды, и пропустите ее через тот же колпачок сетчатого фильтра. Используйте пипетку на 200 микролитров, чтобы собрать всю жидкость с нижней стороны клеточного ситечка.
Запечатайте колпачком, оставьте трубки на льду и защитите их от света. Стратегия гатинга, принятая для выделения фиброадипогенных предшественников и мышечных стволовых клеток, показана здесь. PD GFR alpha E G F P knock у репортерных мышей экспрессирует ген слияния H two B E G F P из эндогенного альфа-локуса PD G FFR, что позволяет эффективно и специфично маркировать альфа-линию PD G GFR.
Чистота изолированных клеточных популяций была подтверждена иммунокоррастацией GFP-положительных фиброадипогенных предшественников и мышечных стволовых клеток антителами PAC-seven. GFP-положительный фиброадипогенный предшественник не экспрессировал маркер PAC-seven, в то время как мышечные стволовые клетки реагировали с этим антителом. Все клетки, экспрессирующие GFP, были положительными для SCA one и отрицательными для CD 31, CD 45 VCAM one и альфа-семь интегрина.
Показаны фиброадипогенные предшественники и мышечные стволовые клетки, выделенные у мышей, травмированных внутримышечными инъекциями без токсина через семь дней после травмы. По мере активации мышечных стволовых клеток происходит увеличение размера клеток. Важно настроить параметры F SCA и SS CA и расширить ворота, включив эти ячейки в центр.
Здесь показана количественная оценка фиброадипогенных предшественников и мышечных стволовых клеток в неповрежденных и семидневных после травмированных та-мышцах. Хотя пик и пролиферация наблюдались между вторым и третьим днями, низкая скорость пролиферации клеток все еще была заметна через семь дней после травмы. Выполнение правильного измельчения мышц имеет решающее значение для высвобождения отдельных клеток.
Кроме того, изоляция мононуклеотидных клеток достигается путем запуска суспензии на 10-миллилитровый шприц с 20-калибровочной иглой. Эта методика поможет ученым изучить биологический транскрипционный и эпигеномный профиль Forbes и мышечных стволовых клеток в нормальном состоянии и на более глубоких этапах регенерации мышц.
