促进软骨再生的逐层Janus碱基纳米基质的制备和表征

该协议显示了我们如何在分子水平上逐层组装和表征JBNm。JBNm包封TGF-B1，并防止其在周围组织中释放，从而促进局部软骨形成。JBNm 的形成是标准化的，允许为未来的应用形成不同的 JBNm。

独特的逐层结构允许生长因子封装，产生稳定的局部释放，从而避免肥大并维持生长。JBNm由于其可注射性，在密闭位置内为软骨组织再生提供了稳态微环境，可用于不同的场景，例如不规则形状的骨折或空腔。首先，将悬浮在水中的每毫升一毫克的TGF-B1加入32微升每毫升1毫克的Matrilin-3悬浮在水中。

移液以确保这些蛋白质的适当混合。每毫升加入80微升1毫克。Janus碱基纳米管，或悬浮在水中的JBNts，到TGF-B1，Matrilin-3溶液。

反复移液以确保正确混合。对于 JBNt 组，将 5 微升每毫升 1 毫克的 JBNts 加入 50 微升水中，制成每毫升 90.9 微克的溶液。对于Matrilin-3组，将40微升每毫升10微克的Matrilin-3加入15微升水中，制成每毫升7.3微克的溶液。

对于TGF-B1组，将10微升10微克/毫升TGF-B1加入45微升水中，制成每毫升1.8微克的溶液。对于Janus Base Nano-Matrix或JBNm组，添加40微升每毫升10微克，Matrilin-3至10微升每毫升10微克TGF-B1。搅拌以确保正确混合。

然后，向溶液中加入五微升每毫升 JBNts 一毫克，重复移液以混合样品。使用分光光度计，测量每组的吸收光谱。按照制造商的说明，使用蛋白质标记试剂盒标记TGF-B1。

将20微升20微克/毫升，标记为TGF-B1，加入25微升水中，制成每毫升8.9微克的测试溶液。使用单独的标记试剂盒标记Matrilin-3。将20微升80微克每毫升标有Matrilin-3的水加入25微升水中，制成每毫升36微克的测试溶液。

将20微升每毫升80微克标记的Matrilin-3与20微升每毫升标记TGF-B1的20微克和5微升的水混合，得到标记的TGF-B1，Matrilin-3化合物。将混合物移液几次以混合。将 5 微升每毫升 JBNts 一毫克的 JBNts 加入 40 微升水中，得到每毫升 111 微克的溶液。

然后将每毫升JBNts加入5微升1毫克的JBNts到标记的TGF-B1，Matrilin-3溶液中，并重复移液以混合化合物。将每个样品组转移到黑色384孔板的孔中。将板装入多模式酶标仪，并按照制造商的方案在488和555纳米的激发波长下进行测量。

在生理条件下，Matrilin-3的zeta电位谱因其等电点而带负电。将TGF-B1添加到Matrilin-3中后，TGF-B1Matrilin-3化合物的zeta电位增加到接近中性的值。JBNm的zeta电位在3个组中最高。

紫外可见吸收光谱证实了JBNm的分层内部结构、赖氨酸侧链的芳环和JBNts的吸收峰的形成，分别在220和280 nm处。TEM用于表征JBNts和JBNm的形态。与蛋白质结合后，观察到JBNm的厚束形成支架结构。

荧光显微镜证实了逐层结构的存在，并证明了JBNm的横截面。标记后的红色荧光Matrilin-3包裹着JBNt束，并形成JBNm的外层，而绿色荧光TGF-B1形成内层。标记的TGF-B1基团的荧光共振能量转移在520纳米处显示出发射峰，Matrilin-3基团的发射峰为570纳米。

探讨了JBNm对HMSC粘附和细胞增殖的影响。JBNm显示HMSC与自身一起聚集，而粘附在JBNts上的细胞较少。JBNm上的细胞排列和细胞大小表明JBNts在细胞粘附中起作用，而蛋白质增加了细胞粘附的亲和力。

在细胞培养的第一天后，与其他组相比，JBNm和TGF-B1组显示出显着的细胞增殖。当细胞结构持续时间增加到三天和五天时，JBNm和TGF-B1组表现出更多的细胞增殖。当荧光标记JBNm时，重要的是在添加JBNts之前单独标记和混合TGF-B1和Matrilin-3，以允许逐层结构的正确形成。

对支架的进一步评估可以了解它们在治疗中如何有效。更具体地说，高通量增殖测定，可以在体外和以后的体内确定最佳剂量。这种新颖的NanoMatriX创造使研究人员能够利用基于纳米材料的可注射支架来再生软骨。

这种多模拟方法允许增强雄激素生成和反位点增殖。