このプロトコルは、分子レベルでJBNmを層ごとに組み立てて特徴付けた方法を示しています。JBNmはTGF-B1をカプセル化し、周囲組織への放出を防ぎ、局所的な軟骨形成を促進します。JBNmの形成は標準化されており、将来のアプリケーションのために異なるJBNmを形成することができます。
独自の層ごとの構造により、成長因子のカプセル化が可能になり、安定した局所放出が作成され、肥大を回避し、成長を維持します。JBNmは、不規則な形状の骨折や空洞などのさまざまなシナリオに使用できる注射能力により、限られた場所で軟骨組織再生のための恒常性微小環境を提供します。はじめに、水に懸濁した1ミリリットルあたり1ミリグラムのTGF-B1を8マイクロリットル、水に懸濁した1ミリリットルあたり1ミリグラムのマトリリン-3を32マイクロリットル加えます。
これらのタンパク質の適切な混合を確実にするためのピペット。ミリリットルあたり1ミリグラムの80マイクロリットルを追加します。ヤヌスベースナノチューブ、または水中に懸濁したJBNtsをTGF-B1、マトリリン-3溶液に。
適切なブレンドを確実にするために繰り返しピペットします。JBNtグループの場合、50マイクロリットルの水に1ミリリットルあたり1ミリグラムの5マイクロリットル、JBNtsを加えて、1ミリリットルあたり90.9マイクログラムの溶液を作ります。マトリリン-3グループの場合、1ミリリットルあたり10マイクログラムの40マイクロリットルのマトリリン-3を15マイクロリットルの水に加えて、1ミリリットルあたり7.3マイクログラムの溶液を作ります。
TGF-B1グループの場合、1ミリリットルあたり10マイクログラムのTGF-B1を45マイクロリットルの水に10マイクロリットル加えて、1ミリリットルあたり1.8マイクログラムの溶液を作ります。ヤヌスベースナノマトリックスまたはJBNmグループの場合、ミリリットルあたり10マイクログラムの40マイクロリットル、ミリリットルあたり10マイクログラムのマトリリン-3を10マイクロリットルTGF-B1に追加します。適切な混合を確実にするために攪拌します。
次に、1ミリリットル当たり1ミリグラムのJBNtsを5マイクロリットル溶液に加え、ピペッティングを繰り返してサンプルを混合する。分光光度計を用いて、各群の吸収スペクトルを測定する。TGF-B1は、製造元の指示に従って、タンパク質標識キットを使用して標識します。
TGF-B1とラベル付けされた20マイクログラム/ミリリットルを25マイクロリットルの水に加え、1ミリリットルあたり8.9マイクログラムのテスト溶液を作ります。別のラベリングキットを使用して、マトリリン-3にラベルを付けます。20マイクロリットルの80マイクログラム/ミリリットルの標識マトリリン-3を25マイクロリットルの水に加え、1ミリリットルあたり36マイクログラムの試験溶液を作ります。
20マイクロリットルの標識マトリリン-3を1ミリリットル当たり20マイクログラムの標識TGF-B1と20マイクロリットルの1ミリリットル当たりの20マイクログラム、および5マイクロリットルの水と混合し、標識TGF-B1、マトリリン-3化合物を得る。混合物を数回ピペットで混合する。1ミリリットルあたり5マイクロリットルのJBNtsを40マイクロリットルの水に加えると、1ミリリットルあたり111マイクログラムの溶液になります。
次に、標識したTGF-B1、マトリリン-3溶液に1ミリグラム/ミリグラムのJBNtsを5マイクロリットル加え、ピペットで繰り返し化合物を混合します。各サンプル群を黒色の384ウェルプレートのウェルに移します。プレートをマルチモードマイクロプレートリーダーにロードし、メーカーのプロトコルに従って488ナノメートルと555ナノメートルの励起波長で測定を行います。
生理学的条件下では、マトリリン-3のゼータ電位スペクトルは、その等電点のために負に帯電した。TGF-B1をマトリリン-3に添加した後、TGF-B1マトリリン-3化合物のゼータ電位は中性に近い値まで増加した。JBNmのゼータ電位は3群の中で最も高かった。
紫外可視吸収スペクトルは、JBNmの層内部構造、リジン側鎖の芳香環、およびJBNtsがそれぞれ220ナノメートルおよび280ナノメートルの吸収ピークに寄与することにより、階層層の形成を確認した。TEMは、JBNtsおよびJBNmの形態を特徴付けるために使用された。タンパク質と結合した後、JBNmの厚い束が足場構造を形成するのが観察された。
蛍光顕微鏡は層構造ごとに層の存在を確認し、JBNmの断面を示した。赤色蛍光マトリリン-3を標識した後、JBNtバンドルを包み込み、JBNmの外層を形成し、一方、緑色蛍光TGF-B1は内層を形成した。蛍光共鳴エネルギー移動は、標識されたTGF-B1群で520ナノメートル、マトリリン-3群で570ナノメートルに発光ピークを示した。
HMSCの接着と細胞増殖に対するJBNmの効果を調べました。JBNmは、HMSCがそれ自体と一緒にクラスター化していることを示しましたが、JBNtsに接着する細胞は少なかった。JBNm上の細胞の整列と細胞の大きさは、JBNtsが細胞接着に関与し、タンパク質が細胞接着の親和性を高めることを示しました。
細胞培養1日目後、JBNm群およびTGF-B1群は他の群と比較して有意な細胞増殖を示した。細胞構造の持続時間を3日および5日に延長すると、JBNmおよびTGF-B1グループはさらに細胞増殖の増加を示しました。JBNmを蛍光標識する場合、JBNtsを添加する前にTGF-B1とマトリリン-3を個別に標識して混合し、層ごとの構造を適切に形成することが重要です。
足場のさらなる評価は、それらが治療的治療においてどのように有効であるかの理解を提供することができる。より具体的には、ハイスループット増殖アッセイにより、インビトロで、および後にインビボで最適な投与量を決定することができる。この新しいNanoMatriXの作成により、研究者はナノ材料ベースの注射可能な足場を利用して軟骨を再生することができます。
このポリ模倣アプローチは、アンドロジェネシスおよびカウンターサイト増殖の増強を可能にする。
