脱碳软骨衍生基质支架的制备

此方法提供了一种从原生组织中提取的脚手架，可用于软骨再生的方法。该技术的主要优点是，原生软骨的成分保留在脚手架中，可以促进软骨形成和体外和体内再生。虽然这些方法使用软骨从马窒息关节，软骨从任何其他关节也可以使用。

首先，获得一个完整的尸体关节软骨分离，并删除皮肤多余的脂肪和肌肉组织，如随附的文本协议所述。接下来，定义关节通过执行关节的延伸拐点来表达的位置。做一个水平切口，以达到关节腔。

接下来，做一个垂直切口，以打开关节区域。关节腔充满突触液，在执行正确的切口时，可能会从腔中滴落。继续完全打开关节，去除过多的脂肪，肌肉和肌腱，并通过切开肌腱，保持关节在一起。

仔细检查软骨是否有任何宏观损伤。如果关节软骨没有光泽光滑的外观，或者如果存在证据、起泡、裂口或缺陷，请丢弃软骨并重新开始。使用无菌手术刀从骨骼上取下软骨。

切到亚骨，去除深区软骨。将去除的软骨片收集到含有先前准备的软骨洗涤溶液的 50 毫升管中。在加工过程中，定期在软骨上滴软骨洗涤溶液，以防止软骨干燥。

从所有感兴趣区域收集软骨后，将软骨片在液氮中捕捉冻结五分钟。然后将软骨片转移到50毫升管中，并立即将冷冻切片放入冷冻干燥器中。使用冷冻干燥机将软骨片冻干 24 小时。

完成后，将冷冻干燥的软骨片存放在干燥的地方，在室温下。对于手动加工，用液氮预冷却砂浆和害虫，然后将冻干软骨片放在砂浆中，然后将它们和液氮淹没。用手直接研磨样品约45分钟，直到样品充分粉碎。

或者，要使用铣床自动研磨样品，请首先通过添加液氮来预冷却铣削机的磨削室。然后添加冻干软骨切片，以预设速度碾磨样品几秒钟，长达一分钟。确保所有颗粒都是接地的，并且砂削室底部没有颗粒。

最后，在形成基架之前，请遵循随附的文本协议中描述的去细胞化技术。将带小标签的软骨颗粒转移到圆柱形塑料模具上。将所有气泡压出，以避免脚手架中出现空腔，并完全填充模具。

为避免脚手架出现空腔，确保在用软骨颗粒填充模具时将气泡压出。形成后，在零下20摄氏度下冷冻模具10分钟。然后在冷冻干燥机中将软骨脚手架在模具中冻干 24 小时。

干冻后，小心地从模具中取出脚手架。将脚手架放在365纳米波长的紫外光下，并通宵交叉连接。通过将消毒的脚手架切割成三毫米厚的切片，形成脚手架盘。

然后将脚手架转移到六井板的单独井中。在脚手架上加入一毫升的胆囊细胞膨胀介质，让它们补充水分30分钟。当脚手架补充水分时，在预浸泡脚手架顶部准备电池和移液器 50 微升的预制电池悬架。

然后在37摄氏度下孵育脚手架一小时。使用软体细胞时，请确保它们没有通过第一通道展开，以尽量减少分化细胞的数量。一小时后，将板返回到文化罩，并小心地将脚手架翻过来。

将剩余的50微升细胞悬浮液移出脚手架，并在37摄氏度下再孵育一小时。孵育后，用脚手架在井中加入三毫升的介质。避免将介质直接移液在脚手架上，并轻轻处理培养板，以避免细胞分离。

将盘子返回到孵化器，培养细胞在摄氏37度时将脚手架放在一起。利用组织染色和DNA定量相结合的方法表明，本文提出的方法导致足够的软骨支架去细胞化。结果发现，脚手架不含细胞以及检测不到的DNA水平。

它们还缺乏糖糖，富含胶原蛋白II. 在这里，在与培养了四周的中层干细胞一起生长的脚手架上观察到新基质的形成。糖糖在四周后形成丰富的糖糖。尝试此过程后，在尝试此过程之前，在任何应用程序中使用它之前，必须检查去细胞化是否成功。

按照此过程，可以执行额外的生化分析，如西印迹分析仪，以回答有关其他成分（如生长因子）存在的具体问题。这项技术为组织工程领域的研究人员探索软骨再生策略铺平了道路，这些策略来自异源和合成源的去细胞化组织。应始终采取佩戴实验室外套和手套等预防措施。