Este protocolo muestra cómo ensamblamos y caracterizamos el JBNm capa por capa a nivel molecular. JBNm encapsula TGF-B1 y evita su liberación en el tejido circundante, promoviendo así la condrogénesis localizada. La formación del JBNm está estandarizada, lo que permite formar diferentes JBNms para futuras aplicaciones.
La estructura única capa por capa permite la encapsulación del factor de crecimiento, creando una liberación localizada constante, que evita la hipertrofia y mantiene el crecimiento. JBNm proporciona un microambiente homeostático para la regeneración del tejido del cartílago, dentro de un lugar confinado, debido a su inyectabilidad, que se puede utilizar para diferentes escenarios, como fracturas o cavidades de forma irregular. Para comenzar, agregue ocho microlitros de un miligramo por mililitro TGF-B1, suspendido en agua a 32 microlitros de un miligramo por mililitro Matrilin-3 suspendido en agua.
Pipeta para asegurar la mezcla adecuada de estas proteínas. Añadir 80 microlitros de un miligramo por mililitro. Nanotubos de base Janus, o JBNts suspendidos en agua, a la solución TGF-B1, Matrilin-3.
Pipetear repetidamente para asegurar una mezcla adecuada. Para el grupo JBNt, agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro, JBNts a 50 microlitros de agua para hacer una solución de 90.9 microgramos por mililitro. Para el grupo Matrilin-3, agregue 40 microlitros de 10 microgramos por mililitro Matrilin-3 a 15 microlitros de agua, para hacer una solución de 7.3 microgramos por mililitro.
Para el grupo TGF-B1, agregue 10 microlitros de 10 microgramos por mililitro, de TGF-B1 a 45 microlitros de agua, para hacer una solución de 1.8 microgramos por mililitro. Para el grupo Janus Base Nano-Matrix o JBNm, agregue 40 microlitros de 10 microgramos por mililitro, Matrilin-3 a 10 microlitros de 10 microgramos por mililitro TGF-B1. Agitar para asegurar una mezcla adecuada.
Luego, agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro JBNts a la solución, pipeteando repetidamente para mezclar la muestra. Usando un espectrofotómetro, medir el espectro de absorción de cada grupo. Etiquete el TGF-B1 utilizando un kit de etiquetado de proteínas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Agregue 20 microlitros de 20 microgramos por mililitro, etiquetados como TGF-B1, a 25 microlitros de agua, para hacer una solución de prueba de 8.9 microgramos por mililitro. Etiquete el Matrilin-3 utilizando un kit de etiquetado separado. Agregue 20 microlitros de 80 microgramos por mililitro etiquetados como Matrilin-3 a 25 microlitros de agua, para hacer una solución de prueba de 36 microgramos por mililitro.
Mezcle 20 microlitros de 80 microgramos por mililitro marcados como Matrilin-3 con 20 microlitros de 20 microgramos por mililitro marcados como TGF-B1, y cinco microlitros de agua, lo que resulta en un compuesto etiquetado TGF-B1, Matrilin-3. Pipetear la mezcla varias veces para mezclar. Agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro JBNts a 40 microlitros de agua, lo que resulta en una solución de 111 microgramos por mililitro.
Luego agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro JBNts a la solución etiquetada de TGF-B1, Matrilin-3, y pipete repetidamente para mezclar el compuesto. Transfiera cada grupo de muestra al pozo de una placa de pocillo negro 384. Cargue la placa en un lector de microplacas multimodo y tome medidas en longitudes de onda de excitación de 488 y 555 nanómetros siguiendo los protocolos del fabricante.
En condiciones fisiológicas, el espectro de potencial zeta de Matrilin-3 se cargó negativamente debido a su punto isoeléctrico. Después de la adición del TGF-B1 a la Matrilina-3, el potencial zeta del compuesto TGF-B1 Matrilina-3 aumentó a un valor casi neutro. El potencial zeta de JBNm fue el más alto entre los tres grupos.
Los espectros de absorción UV visibles confirmaron la formación de la estructura interior jerárquica capa por capa del JBNm, los anillos aromáticos de las cadenas laterales de lisina, y los JBNts contribuyeron a los picos de absorción, a 220 y 280 nanómetros respectivamente. Se utilizó TEM para caracterizar la morfología de los JBNts y JBNm. Después de combinarse con proteínas, se observaron haces gruesos de JBNm formando una estructura de andamio.
La microscopía de fluorescencia confirmó la presencia de la estructura capa por capa, y demostró la sección transversal del JBNm. Después de etiquetar, el fluorescente rojo Matrilin-3 envolvió los haces JBNt y formó la capa externa del JBNm, mientras que el TGF-B1 fluorescente verde formó una capa interna. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia mostró picos de emisión a 520 nanómetros para los grupos TGF-B1 marcados y 570 nanómetros para los grupos Matrilin-3.
Se exploró el efecto de JBNm en la adhesión y proliferación celular de HMSC. El JBNm mostró HMSC agrupados junto con él, mientras que menos células se adhirieron a JBNts. La alineación de las células y el tamaño de las células en el JBNm demostraron que los JBNts desempeñaron un papel en la adhesión celular, mientras que las proteínas aumentaron la afinidad de la adhesión celular.
Después del primer día de cultivo celular, los grupos JBNm y TGF-B1 mostraron una proliferación celular significativa en comparación con los otros grupos. Cuando la duración de la estructura celular se incrementó a tres y cinco días, los grupos JBNm y TGF-B1 demostraron una proliferación celular aún mayor. Al etiquetar fluorescentemente el JBNm, es importante que el TGF-B1 y el Matrilin-3 se etiqueten individualmente y se mezclen antes de agregar los JBNts, para permitir la formación adecuada de la estructura capa por capa.
Una evaluación adicional del andamio puede proporcionar una comprensión de cómo son efectivos en los tratamientos terapéuticos. Más específicamente, un ensayo de proliferación de alto rendimiento, puede determinar la dosis óptima in vitro, y más tarde in vivo. Esta nueva creación de NanoMatriX permite a los investigadores utilizar un andamio inyectable basado en nanomateriales para regenerar el cartílago.
Este enfoque de imitación poli permite una androgénesis mejorada y la proliferación del contrasitio.
